Method Article
Мы опишем способ получения ДНК пулями золота и продемонстрировать использование таких пуль biolistically трансфекции нейронов гиппокампа в культуре ломтиками.
Biolistic трансфекции это физические средства трансфекции клеток бомбардирующих ткани с высокой скоростью ДНК частицы, покрытые. Мы предоставляем подробные протокол для biolistic трансфекции срезах гиппокампа крыс, от первоначальной подготовке ДНК пулями в финал съемки органотипической культур ломтик использованием генной пушки. Трансфекции генов пушка является эффективным и простым средством трансфекции нейронов и особенно полезен для флуоресцентной маркировки небольшая часть клеток в тканях кусочек. В этом видео, мы первые наброски шагов, необходимых, чтобы покрыть частицы золота с ДНК. Далее показано, как линия внутри пластиковой трубкой с золотом / ДНК пули, и как разрубить этот трубопровод для получения пластиковых картриджей для загрузки в генной пушки. Наконец, мы выполняем biolistic трансфекции гиппокампа крыс культур срез, демонстрирующий обработку Bio-Rad Гелиос генной пушки и предложение консультаций устранения неисправностей для получения здоровых и оптимально трансфицированных ломтиками ткани.
ПРОТОКОЛ BIOLISTIC трансфекции
Создание пуль
Пули хороши на срок до 6 месяцев, но может начать снижение эффективности трансфекции через 2-3 месяца. Пули должны храниться при температуре 4 ° С в присутствии осушителем гранул. Всегда давайте сцинтилляционные флаконы, в которых пули хранятся, нагреться до комнатной температуры перед открытием флакона.
Прежде, чем начать есть готовые:
Подготовка трубки:
Осаждения ДНК на золото бисера:
Подготовка ПВП раствора во время обработки ультразвуком:
Промывка золотым бисером с этанолом:
Ресуспендируют золото / ДНК в растворе ПВП:
Покрытие трубки:
Резка трубы:
Съемки срезы тканей
При съемке культурный ломтиками, важно использовать относительно стерильной техники для того, чтобы избежать загрязнения. Помните, что при съемке двух различных конструкций, оба набора пули могут быть загружены в тот же держатель картриджа, но ствол-вкладыш и экран должен быть изменен между конструкциями.
Прежде, чем начать есть готовые:
Prepping генной пушки:
Съемки культурных срезов генной пушки:
Чистящий картридж владельцев и ствол лайнеров:
Устранение неисправностей советы для Biolistic Трансфекция
Biolistic трансфекции иногда может привести к нерациональному условия трансфекции. Это может привести к слишком мало или слишком много клеток, трансфицированных, слишком высокий или слишком низкий уровень экспрессии, или может причинить срезы тканей, чтобы стать вообще вредно для здоровья. Часто результатом нездоровой ломтики от давления взрыва. Вот некоторые подсказки, чтобы получить оптимально трансфицированных ломтиками ткани.
Если ломтики кажутся нездоровыми (или, если слишком много клетки трансфицированных / срез), попробуйте:
Если слишком мало клетки трансфицированных, попробуйте:
Если вы получаете ломтики с обеих слишком много и слишком мало клеток, трансфицированных за тот же съемки убедитесь, что:
Если эффективность трансфекции кажется оптимальной (# клеток, трансфицированных / срез), но уровень экспрессии кажется слишком высокой или слишком низкой:
В случае двойного трансфекции, если вы получаете слишком мало выражению одного из ваших конструкций, настроить соотношение двух конструкций в надлежащей форме и убедиться, что обе конструкции под тем же промоутер, с тем чтобы убедиться, что одна Промоутер не будет из-конкурировать с другом.
Biolistic трансфекции это физические средства трансфекции клеток с помощью бомбардировки живой ткани с высокой скоростью ДНК частицы, покрытые золотом. В частиц опосредованного переноса генов, в общем-трансфицированных клеток результат, когда пуля приходит в состояние покоя в ядре. Хотя много различных методов трансфекции существуют, например, микроинъекции, липофекция, кальций-фосфат трансфекции, электропорации и вирусной трансфекции, biolistic трансфекции может предложить менее трудоемким и эффективной альтернативой для трансфекции клеток, которые не так легко трансфекции с помощью других методов. На самом деле, он был впервые разработан в качестве методики переноса генов в растениях так как наличие клеточной стенки сделаны трансфекции трудно использованием существующего метода 1. Точно так же biolistics приобрел популярность в области нейробиологии с пост-митотического нейронов, которые заведомо трудно трансфекции 2,3. В частности, она широко известна как принцип техники, которые будут использоваться в экспериментах, направленных на оценку тонкой морфологии отдельных нейронов в интактных ломтики мозга. Методы, описанные здесь, обеспечивают детальное и всестороннее объяснение, как выполнить biolistic трансфекции культурный ломтики мозга с помощью ручных генной пушки (Helios генной пушки системы; Bio-Rad).
Biolistic трансфекции стала предпочтительным методом трансфекции нейронов в срез культуры, поскольку она позволяет трансфекции редкими количество клеток по всему мозгу срез. Таким образом, отдельные нейроны могут рассматриваться в изоляции. Так как этот метод особенно хорошо подходит для трансфекции нейронов в мозге ломтик, он часто используется в сочетании с 2-фотонной микроскопии, так как 2-фотонного возбуждения позволяет визуализацию флуоресцентно меченых клеток глубоко внутри ткани рассеяния света 4. Действительно изображения с высоким увеличением одного пирамидных нейронов, представленные в этом видео были получены с помощью пользовательских построен 2-фотона лазерного сканирующего микроскопа. В заключение biolistic трансфекции является эффективным средством трансфекции отдельных клеток в контексте высокой плотностью окружающих клеток, и как таковое оказалось чрезвычайно полезным для флуоресцентной маркировки отдельных нейронов в нейронной культуры срез.
Мы хотели бы поблагодарить Марка Lucanic и Хуай-Чен Ченг за помощь в приобретении изображений с низким увеличением целых срезах гиппокампа, представленные в этом видео. Мы также хотели бы поблагодарить Сара Пэриш за помощь с текстом сопровождающие видео.
Хотя мы перечислили все продукты по отдельности, это более экономично приобрести "Гелиос Ген-Gun System", которая включает в себя все продукты Bio-Rad, перечисленных выше (кошка # 165-2431).
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены