Хроматин Пробирной по правам ткани мозга

Резюме

До недавнего времени выражение исследования человеческого мозга были ограничены количественного РНК или белка. С хроматин иммунопреципитации методы описаны в этой статье, можно будет сопоставить гистонов метилирование и других эпигенетических регуляторов экспрессии генов в посмертных мозг.

Аннотация

Хронический психоневрологических заболеваний, таких как шизофрения, биполярное заболевание и аутизмом, как полагают, является результатом сочетания генетических и экологических факторов, которые могут привести к эпигенетических изменений экспрессии генов и других молекулярных патологии. Традиционно, однако, выражение исследований в посмертных мозга были приурочены к количественной оценке мРНК или белка. Ограничения встречаются в посмертных исследований мозга, такие как изменчивость в аутолиза времени и ткани целостностей также возможных последствий любого исследования высшей структуры хроматина порядке. Тем не менее, нуклеосомной организации геномной ДНК, включая ДНК: основные гистонов обязательным - как представляется, в значительной степени сохранились в репрезентативных выборок, предоставляемых различными банками мозга. Таким образом, можно изучать метилирования и другие ковалентные модификации гистонов ядро ​​в определенные геномных локусов в посмертных мозг. Здесь мы приведем упрощенную родной хроматин иммунопреципитации (NChIP) протокол для замороженных (никогда не фиксированной) образцы человеческого мозга. Начиная с микрококковой нуклеазы пищеварения мозга гомогенатов NChIP следуют КПЦР может быть завершена в течение трех дней. Методология, представленная здесь, должно быть полезным для выяснения эпигенетические механизмы экспрессии генов в нормальных и больных человеческого мозга.

протокол

Порядок действий:

^1-й день

1. Однородный 50-500 мг замороженных посмертного серое вещество ткани с Douncing буфера.

! ВНИМАНИЕ -! Правам ткани должны быть обработаны с осторожностью, под строгим условиям безопасности. Обращайтесь в BSL-2 или более высоким стандартам безопасности.

1. Возьмите ранее рассеченные, посмертные мозг от -80 ° C, Dounce их в 5 раз объем мозга Douncing буфера, и место в трубку 2,0 микроцентрифужных мл. Согласованные образца и контроля пар обрабатываются одновременно.

2. Микрококковой нуклеазой (MN) Пищеварение

1. Добавить 5U/mL из микрококковой нуклеазы к образцу и смешивать в растворе с помощью пипетки вверх и вниз перед размещением на льду.
   * Важный шаг - Важно сделать этот шаг, быстро, поскольку MN имеет способность действовать на еще 4 ° C.
2. Инкубируйте образцы в течение 7 минут при температуре 37 ° C.
3. После 7 минут инкубации, добавляют 0,5 М ЭДТА до концентрации 10 мМ, чтобы остановить MNase деятельности.

3. Hypotonisation

1. Место образцов в 15 мл трубки сокола. Добавить 10X образца объемом 0,2 ЭДТА, 1 / 2000 объем пробы 0,2 М benzamidine и 1 / 1000 образцов объемом phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 М (PMSF). Последние два соединения используются в качестве ингибиторов протеазы.
   * Важный шаг - Важно сохранить образцы на льду во время всех этих шагов.
2. Инкубируйте образца на 1 час, в то время вортексе его каждые 10 минут.
3. В конце часовой инкубации, добавить 1 / 2000 объема образца 3М DTT, еще один ингибитор протеазы.
4. Vortex образец еще раз и центрифуге при 3175 RCF в течение 10 минут при 4 ° C.
   * Факультативный шаг - Precleansing с Protein G агарозы.
   1. Возьмите супернатант и поставить в новый 15 мл трубки сокола.
   2. Добавить 500 мкл белка G агарозы.
   3. Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин.
   4. Центрифуга при 4000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C.
5. Распространение супернатант, так что 500 мкл используются в качестве входного контроля (содержащие только геномной ДНК), а остальное разделить на две пробирки, содержащие 1600 мкл образца каждого, - которые для иммунопреципитации хроматина (чип) образцов.
6. Входной контроль находится при температуре -80 ° CO / N до последующего использования.
7. Для ChIP образцов - добавить 1:10 Объем 10XFSB и 4μg антител, то вихрь образцов и поворачивать их при температуре 4 ° С в течение ночи.
   ! ВНИМАНИЕ -! Количество и разведение антител может потребовать оптимизации.

^2-го дня

! ВНИМАНИЕ! - Начало ^2-й день, если мыться Protein G агарозы, который будет использоваться для изоляции нуклеосомной ДНК. С агарозном бисер очень чувствительны, надо отрезать глав советов, когда любой пипетки раствор, содержащий агарозном бисером.

1. Зондирование Protein G агарозном Бусины с ДНК

1. Добавить 1,6 мл 1XFSB до 245 мкл белка G-агарозы (достаточно для 4 труб) в 2 мл микроцентрифужных трубы (петли).
2. Отдельное решение на две 2 мл труб и пополнить каждая до 1,6 мл с 1X ФСБ.
3. Поворот при комнатной температуре в течение 30 сек и центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
4. Удалить супернатант использованием вакуума.
5. Добавить 1,6 мл 1X ФСБ еще раз. Поворот образцов в течение 30 секунд, а затем центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
6. Удалить супернатант еще раз, и объединить обе трубы с 1,5 мл 1XFSB.
7. Добавьте 15 мкл ультразвуком ДНК спермы лосося (10mg/mL).
   ! ВНИМАНИЕ -! Этот шаг должен, в принципе, уменьшить неспецифическое связывание иммунопреципитации с бисером. Однако это также может привести к ложным положительным результатам для некоторых (человека) последовательностей ДНК.
8. Поворот при комнатной температуре в течение 30 мин, затем центрифуги на 0,1 RCF на 30 сек.
9. Удалить супернатант. Добавить 200 мкл 1XFSB.
10. Добавить 90 мкл из бисера агарозы в каждый чип образца. Поворот при 4 ° С в течение 1 часа.
11. Добавить 1 мл 1XFSB в оставшиеся бисером агарозы в качестве отрицательного контроля и вращаются на 4 ° С в течение 1 часа.
12. После часовой инкубации, центрифуги образцов и отрицательного контроля на уровне 0,1 RCF на 30 сек. Удалите супернатант.

2. Стиральная бисер

! ВНИМАНИЕ! - Стиральная буферы должны храниться при температуре 4 ° С до использования, и будут использоваться только в том случае меньше, чем месяц назад.

1. Добавить 1 мл каждого мытья решение бисером и вращаться в течение 3 мин при комнатной температуре.
2. Центрифуга на 0,1 RCF на 30 сек.
3. Удалите надосадочную использованием вакуума.

* Каждый моющего раствора

- Низкий буфер мытье соли

- Высокая буфера стиральной соли

- Раствор Хлорид лития - только вращаться при комнатной температуре в течение 1 минуты!

- TE буфера (10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА рН = 8)

3. Элюирование

* Важный шаг - Сделать свежие буфера элюции для каждого эксперимента на день она будет использоваться.

1. Добавьте 250 мкл свежеприготовленного элюции буфера каждого образца.
2. Поворот на 15 минут при комнатной температуре, а затем центрифуги в 0,4 RCF в течение 1 мин.
3. Сохранить супернатант в микроцентрифужных 2,0 мл трубки (Loop).
4. Добавьте 250 мкл буфера для элюции каждого образца и вихревые вручную в течение нескольких секунд. Затем вихрь образцов в течение 15 минут на mulitvortexer.
5. Центрифуга на 16 оборотов в минуту RCF в течение 4 минут и сохранить супернатант в том же 2,0 мл трубки (Loop).

4. Дайджест белка

1. Добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА, 25 мкл 0.8M Tris-HCl, рН 6,5, 10 мг / мл протеиназы К (1 / 200 проба), чтобы каждый чип образца.
2. Для каждого входного контроля, добавить буфер для лизиса протеиназы К пищеварения (1 / 10 образца буфера) и 10mg/ml протеиназы К (1 / 200 образца буфера).
3. Инкубируйте Входные и ChIP образцов в 52 ° С в течение 3 часов.

5. Фенол / хлороформ добычи

! ВНИМАНИЕ -! Эксперимент требует фенол / хлороформ должна быть выполнена под капотом. Используйте нитриловые перчатки при работе с фенол / хлороформ.

1. После 3-часовой инкубации, мы добавляем 500 мкл фенол-хлороформ для каждого образца.
2. Vortex всех образцов в течение нескольких секунд, затем центрифуге при 13 RCF оборотов в минуту в течение 5 мин.
3. На данный момент, две фазы будут присутствовать, и мы заинтересованы в содержании верхней фазе. Выньте верхнюю фазу и положить его в 2 мл микроцентрифужных трубки.
4. Добавить смесь 2μL гликогена и 50 мкл 3М ацетата натрия к каждому образцу наряду с 1,375 мл 100% этанола.
5. Vortex всех образцов энергично. Поместите их в -80 ° С в течение ночи.

^3-го дня

1. Удалить образцы формы -80 ° C и поместите их на лед для них оттепели.
2. Центрифуга на 15 RCF в течение 10 минут при 4 ° C.
3. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул в нижней части трубы.
4. Добавьте 1 мл холодного 75% этанола на каждого образца, затем инвертировать их 4-6 раз.
5. Центрифуга на 18 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
6. Удалить супернатант еще раз и позволяют гранулы высохнуть на воздухе.
7. Растворить сухой гранул в 50 мкл 4 мм Трис-HCl, PH8 и хранить при температуре -80 ° C до последующего использования.

Обсуждение

Протокол изложенных здесь особенно полезен для следователей интересует гистонов и / или метилирования ДНК подписей человеческого мозга, потому что эти хроматина маркировка может быть менее склонными к посмертной артефакты по сравнению с другими типами модификаций, в том числе (гистонов) ацетили...

Материалы