Нейтрофилов Изоляция протокола

Резюме

Нейтрофилы являются одними из первых клеток, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа, а также их функции и механизмы хорошо изучены в лабораторных условиях. Мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных раздела сред.

Аннотация

Нейтрофилов полиморфноядерных гранулоцитов (PMN) являются наиболее распространенными лейкоцитов в организме человека и одним из первых клетках, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа. Из-за их ключевую роль в воспалении, нейтрофилов функции, такие как передвижение, продукции цитокинов, фагоцитоз, и опухоль боевой ячейки хорошо изучена. Чтобы охарактеризовать специфические функции нейтрофилов, чистый, быстрый и надежный метод, отделяющий их от других клеток крови желательно в лабораторных исследованиях, тем более, что нейтрофилы являются короткоживущими и должны быть использованы в течение 2-4 часов после сбора. Здесь мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных разделение средств массовой информации, что представляет собой смесь натрия и metrizoate Декстран 500. Процедура состоит из слоев цельной крови в среднесрочной градиента плотности, центрифугирование, отделение слоя нейтрофилов, и лизиса остаточных эритроцитов. Затем клетки промывают, рассчитывали, и ресуспендировали в буфере для желаемой концентрации. При правильном выполнении этого метода было показано, что выход образцы> 95% нейтрофилов с> 95% жизнеспособность.

протокол

Нейтрофилов Изоляция протокола

1. Довести все реагенты до комнатной температуры.
2. Сбор 5,0 мл нейтрофилов изоляции СМИ в центрифуге трубки. Тщательно слой 5,0 мл крови за разделение средств массовой информации. Данный шаг следует выполнять медленно и осторожно, и с кончика пипетки близко к поверхности, средств массовой информации, чтобы избежать смешивания крови и средств массовой информации.
3. Центрифуга при 500 RCF в течение 35 минут при температуре 20-25 ° C. Кровь должна выделить на 6 отдельных полос: плазма, моноцитов, изоляция СМИ, нейтрофилы, больше СМИ изоляции и красных клеток крови гранул (рис. 1). Если эти группы не ясны, процесс разделения не было чистым и необходимо будет повторить.
4. Аккуратно снимите верхнюю три слоя (плазма, моноциты, и изоляции средств массовой информации) с помощью пипетки. Утилизация этих слоев.
5. Тщательно пипеткой слой нейтрофилов и все средства массовой информации изоляции под нейтрофилов. Место раствор в чистую пробирку центрифуги.
6. Развести нейтрофилов решение до 10 мл HBSS без Са ² + / Mg ² +. Обратить трубку несколько раз, чтобы приостановить клеток.
7. Центрифуга нейтрофилов решение при 350 RCF течение 10 минут. Красный шарик должен присутствовать на дне пробирки, содержащие нейтрофилов и остаточной красных кровяных телец (эритроцитов). Удалить супернатант с пипеткой осторожно, чтобы шарик не нарушается.
8. Для лизиса остаточных эритроцитов, добавляют 2 мл красного буфера лизиса клеток к трубе. Для ресуспендирования гранул, вихревые флаконе установка 3-4. Избегайте увеличения вихревой настройки выше 4, так как это может привести к активации нейтрофилов. Это может быть необходимо, чтобы вихрь в течение нескольких секунд, или "пульс" вихрь, чтобы растворить гранулы.
9. Центрифуга трубке при 250 RCF в течение 5 мин. Удалить супернатант с пипеткой. Повторите лизировать процесс, если требуется.
10. Добавить 500 мкл HBSS без Са ² + / Mg ² + в каждую пробирку. Опять же, вихрь для ресуспендирования гранул в установке 3-4. Развести в 10 мл HBSS без Са ² + / Mg ² +.
11. Центрифуга труб при 250 RCF в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и выбросьте.
12. Ресуспендируют осадок в 250 мкл HBSS / HSA Решение (2% HSA). Ячейки могут быть посчитаны и доводят до нужной концентрации.

Обсуждение

Разделение градиента плотности метод используется для изоляции нейтрофилов человека из цельной крови с использованием смеси натрия metrizoate и Декстран 500. Этот метод основан на мононуклеарных лейкоцитов метод разделения Boyum (1968), который был модифицирован для нейтрофилов разделения Ферранте и стри...

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Lymphocyte Poly(R)	Reagent	Cedarlane Labs		PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium Chloride	Reagent	Invitrogen Gibco
Human Serum Albumin	Reagent	ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer	Reagent	Roche Diagnostics
Centrifuge	Tool
Vortexer	Tool
Pasteur Pipettes and bulb	Tool
PolymorphprepTM	Reagent	Axis-Shield PoC		Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter	Other	Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank's Balance Salt Solution with Calcium Chloride	Reagent	Invitrogen Gibco