Первичная диссоциированных мозга Допамин клеточных культур от грызунов Новорожденные

Резюме

Первичная диссоциированных культурах допамина мозга ячейки позволяют изучение характеристик пресинаптических дофаминовых нейронов. Они могут быть использованы для мониторинга в режиме реального времени высвобождение дофамина кинетики и белка / мРНК регуляторов допамина экзоцитоза. Здесь мы покажем вам, как создать эти культуры от грызунов новорожденных.

Аннотация

Возможность создания первичных клеточных культур дофаминовых нейронов позволяет для изучения характеристик пресинаптических дофаминовых нейронов в отрыве от системного участии в других местах в головном мозге. В нашей лаборатории мы используем эти нейроны оценить допамина кинетики релиз использованием углеродного волокна amperometry, а также выражение уровень допамина связанных генов и белков с использованием количественных ПЦР и иммуноцитохимия. В этом видеоролике мы покажем, как мы генерируем эти культуры от грызунов новорожденных.

Процесс включает несколько этапов, в том числе покрытие корковых глиальные астроциты, кондиционирования нейронов СМИ культуре клеток глии подложки, рассечение мозга у новорожденных, пищеварение, экстракции и покрытие дофаминовых нейронов и того нейротрофических факторов обеспечить выживаемость клеток.

Применениям для таких подготовки включают электрофизиологии, иммуноцитохимия, количественный ПЦР-, видео-микроскопии (т. е. в режиме реального времени везикулярного слияния с плазматической мембраной), анализы жизнеспособность клеток и других токсикологических экранов.

протокол

Подготовка Предшествующие культуры

Примечание: ** глиальные клетки должны быть покрыты заблаговременно, с тем, что у них есть время, чтобы размножаться и покрывает дно посуды. Для мышей с атипичными или экспериментальные генетический фон, убедитесь, что в соответствии глиальных и нейрональных культурах с точки зрения генотипа.

Примечание: ** 1-7 дней до вскрытия, подготовки свежих нейронов среднего и заменить глиальных среды в блюда с 2 мл.

Примечание: ** За день до вскрытия, следующие элементы должны быть оставлены в УФ-свете с ночлегом:

• 4 пластины рассечение
• 2 диссоциации флаконах с микро-магнитной мешалкой
• 2 флакона колпачков (с 2-мя маленькими отверстиями ткнул в верхней части)
• Разложите слайд кольца (и пальто в 70% этанола) - оставить окно открытым и
• По крайней мере 2 полными коробками желтых (10-200 мкл) наконечники
• 1 коробка синего (100-1000μl) наконечники

День культуры

Примечание: * Убедитесь, что не трогайте ничего, что осталось OUT для УФ ночным!

Поддержание стерильных условиях под капотом очень важно.

1) Настройка:

Примечание: ** Отложите все замороженные компоненты, чтобы сделать папаин решение.

1. Чистая щипцы с 70% этанола. Обложка каждого наконечник с желтым кончиком стерильной пипеткой. Используйте для стерильных место кольца слайд в своей коробке.
2. Горячая пластина:
   1. Место mini-magnetic/hot пластины под капот с 1000 мл стакан заполнен до 500-600мл дН ₂ O и большой магнитной мешалкой.
   2. Место диск пенополистирола в стакане чуть выше уровня воды.
   3. Слайд термометра в маленькое отверстие в диске пенополистирола. Тепло набора должна быть чуть выше 2 (для темп 34 ° С) и перемешать набора должна быть ~ 5-6.
3. PBS:
   1. Подготовка стерильной PBS и заполнить 15 стерильные 15 мл пробирки с 4-6 мл (не забудьте сохранить стерильный
      техники).
   2. Место труб и акции бутылки на лед рядом с капюшоном.
4. Карбогена:
   1. Перерыв 5 мл stripette пополам и нажмите на нее через резиновую пробку, так что кончик stripette торчит широкий конец пробки.
   2. Место пробку в 500 мл колбу с 400-500мл дН ₂ O (сломанный конец stripette должно быть в дН ₂ O).
   3. Подключите трубку на боковое отверстие колбы.
   4. Отрежьте кончик желтый наконечник пипетки и подключить его к концу трубки (с разрезанной стороной наружу).
      
      Подключите карбогена бак до кончика 5 мл stripette.
      
      
5. Подготовка папаин sol'n:
   1. * Используйте осторожно стерильной техники.
   2. Смешайте в стерильные 50 мл трубки.
6. Фильтры папаин sol'n во флакон диссоциации:
   1. Используйте блок Steriflip фильтрации и передачи флакон 25мл диссоциации через stripette (или местом, новым 0,2 мкм фильтр шприца на кончике шприца 20мл,
      удалить поршень и использовать stripette (25 мл), чтобы передать все sol'n папаин в шприц.
   2. Фильтр в пробирку диссоциации).
   3. Крышка флакона, вставить стерильного шприца через отверстие в крышке и приложить стерильную 0,2 мкм фильтр шприца до основания шприца.
   4. Подключите карбогена к фильтру и парафильмом этом на месте. Место флаконе в пенополистирола диск / держатель.
      
      * Микро-магнитной мешалкой должно быть в движении.
      * Газ должен делать его в пробирку.
      * Температура должна стабилизироваться на уровне 34 ° C.
      
      
7. Препарирование приготовительные:
   1. Принесите рассечение микроскоп под капотом.
   2. Разложите все рассечение инструментов на алюминиевую фольгу, спрей с 70% этанола, слейте избыток и оставить под капотом высохнуть.
8. Подготовка нейронной среды:
   1. Оставьте 30 мл свежего нейронной среды в инкубаторе.
9. Выложить один большой квадрат из алюминиевой фольги и 12 маленьких квадратов. Оставьте обезглавливание ножницы с алюминиевой фольгой. Заполните небольшую коробку пенополистирола с ледяной водой и оставьте все за пределами капотом.
10. Подготовка анестезии (кетамин и 0.075ml 0.075ml xzylazine).
11. Получите по крайней мере 12 щенков (P0-P2) на 100 пластин. Для мышей, убедитесь, что генотип матче за весь помет. Если генотип неизвестно, плиты клетки от каждого щенка на отдельном блюде, вести точный учет мыши цифры и сопоставить их с блюдами культуре клеток и убедитесь, что генетический фон глиальных субстрат равномерно через клеточные культуры.

2) Препарирование

1. Обезболить первое животное с внутрибрюшинного введения. Когда животное проявляет седативного эффекта и не реагирует на хвост Флик испытаний; положил его во льду в течение 30 секунд (пока гипотермия). Промыть одной маленькой алюминиевой фольги квадрат, decapтации ножницы, и голову с 70% этанола.
2. Обезглавьте, позволяют голову падают на алюминиевой фольги квадрат и двигаться под капотом. Аккуратно снимите мозг в 15 мл трубки ледяной PBS. Место трубку обратно на лед при удалении следующего мозга.
3. Повторите эти первые шаги, пока Есть 3 мозги на льду. Залить все 3 мозги и PBS, на первое блюдо рассечение под микроскопом. Удалите соответствующий раздел мозга (VTA) и использовать передачу пипетки поставить сегментов в папаин sol'n. Начало таймер, когда первые сегменты войти
4. Повторите предыдущие три действия, пока все мозги переваривается в папаин. Среднее время для переваривания пищи должен быть 2 часа. Первые сегменты были в течение приблизительно 1 часа к тому времени, последние из них войти
   
   Попробуйте разделить разницу.
   
   
5. * Во время пищеварения:
   1. Убедитесь, что температура в ванне 34 ° C.
   2. Сегменты могут прилипнуть к мешалкой сначала, но должно было распространено, как время идет. Если они не будут, нажмите дне флакона.

3) Растирание:

1. Использование передачи пипетки, передача мозга сегменты стерильные 15 мл трубки (старайтесь избегать избыточного папаин sol'n) и промыть их 3 раза с 2 мл подогретой глиальных среды из инкубатора. После сдачи глиальных СМИ в трубке, позволяющие сегментов отстояться и затем осторожно удалить как можно больше sol'n возможно, не нарушая сегментов. Изменение пипетки, чтобы избежать загрязнения!
   
   ** НЕ ДЕРЖИТЕ sol'n, что удаляется.
   
   
2. Использование свежей пипетки передачи начинаются triturations в 2 мл глиальных СМИ. Растирают в 25 раз (избегайте впуская пузырьки воздуха), и пусть сидят трубку в течение 3 минут, пока недиссоциированных сегментов обосноваться. Использование передачи пипетки удалить, и держать столько sol'n возможно, не нарушая сегменты в нижней части. Держите супернатант в новой (стерильные) 15 м трубы.
3. Повторите предыдущий шаг, используя 1000μl пипетки и 200 мкл пипетки до полного диссоциирован.
4. Растирают в 10 раз с передачи пипетки, или пока клетки полностью ресуспендировали в sol'n.

4) Клетки Покрытие

1. Использование стерильных желтый наконечник пипетки по каждой кончик пинцетом, осторожно удалить слайд кольцо, как в центре, чтобы стекла, а также возможные в каждом блюде.
2. Поместите 10 мкл ячейки решение на hemacytometer и считать. (Исключить нежелательной массы).
3. Умножьте количество клеток на 10. Это число клеток / мкл. Разделите 1,000,000-1,500,000 (или желаемой плотности) на это число. Это число мкл, чтобы добавить в блюдо.
4. Использование пипетки скользить кольца, над центральной и каждого блюда по мере добавления соответствующих мкл / блюдо. Пластина их мягко и переключиться советов для каждого блюда.
5. Добавить 100 мкл (из разбавленных) GDNF sol'n внутри слайд кольцо каждого блюда.
6. В это время, место лотков в инкубаторе и принести нейронной среды в холодном помещении.
7. Разрешить клетки решить в одночасье.
8. Следующий день: снимите кольца (с использованием новых стерильные наконечники пипеток покрытие щипцов советов для каждого блюда)
   

5) Митотическая Ингибирование: СЛЕДУЮЩИЙ ДЕНЬ

1. Развести FDU аликвоты 1000X 1:10 акции путем добавления 200 мкл фондовом FDU до 1,8 мл стерильного MEM.
2. Добавить 20 мкл разбавленного FDU sol'n к внешнему кольцу каждого блюда. Изменение наконечники часто. Накрыть крышкой и вернуться в инкубаторе.
   
   * Беспокоить блюда как можно меньше в течение следующих 7-10 дней. Проверьте инфицированных блюд и удалять зараженные блюда при первых признаках инфекции. Культуры готовы для тестирования в течение 3 недель.

МЕДИА / РЕШЕНИЯ

Нейронов среднего

(На 200 мл)

** Лучше всего, если в зависимость от глии из колбы ночь перед использованием для мойки / растиранием

Ингредиент	Количество	Примечания
BSA 5%	0,5 г	Доля V
MEM жидкости	94,0 мл	Сигма
DMEM жидкости	80,0 мл	Сигма
F-12 жидком	20,0 мл	Сигма
Глюкоза 45% жидкости	1,50 мл	Sigma решение
Глутамин 200 мМ	0,5 мл	Aliquotted решение Sigma
Diporzio Конц.	2,0 мл	Sigma решение
Жидкие Каталаза	0,1 мл
Кинуреновой кислоты 0,5 М	200 мкл	В 1N NaOH
HCL 5N	50 мкл

1. Комбинат ингредиенты (BSA идет последним) в 250 мл пластиковые бутылки.
2. Фильтр, этикетки, и поставить в холодильник.

Кинуреновой кислота
(FW = 189,2)
0,5 М = 94.6mg/ml
Сделать 8ml складе: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH и пипеткой в ​​стерильную аликвоты 200 мкл

DiPorzio СМИ

) DiPorzio Конц. Акции:

НУЖНА			Объединять			Alliquot
Добавка	Растворитель	Трубка	Количество	мл	мл / трубки	Конц.	Количество	# Алик.
Инсулин	20 мМ HCL (1)	пластик	250 мг флакон	10	1	25mg/ml	25 мг	10
Трансферрина	Хэнка		500 мг флакон	5	1	100мг/мл	100 мг	5
SOD	Хэнка		70мг флакон	14	1	5mg/ml	5 мг	14
Путресцин	Хэнка		50 мг	3	0,12	20mg/ml	2.4mg	21
Na 2 SeO 3	Хэнка		0.104mg	10	0,5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10 мМ NaOH		2мг	10	0,1	0.20mg/ml	0 мг	100
Прогестерон	100% этанола	Стекло	12,5 мг	10	0,05	1.25mg/ml	Используйте пипетку
Кортизол	100% этанола	Стекло	20мг	10	0,02	2.00mg / мл	Используйте пипетку

1. 20 мМ HCl = 41.5μl конц. HCl/25ml.
2. Сделать 1mg/ml акции и добавить 104μl на 10 мл.

Б) DiPorzio СМИ складе:

Добавка	Сумма (мл)	Сумма (мл) X2	Заключительные Конц. мкг / мл	Заключительные Конц. Молярность
Прогестерон	0,05	0,1	0,06	200 нм
Кортизол	0,02	0,04	0,04	125nM
Хэнка BSS	6,21	12,42
Инсулин	1	2	25
Na 2 SeO 3	0,5	1	0,01	30нм
T3	0,1	0,2	0,02	30нм
SOD	1	2	5
Путресцин	0,12	0,24	2,4	15nM
Трансферрина	1	2	100

1. Используйте 15 мл polyproylene стерильную пробирку добавить прогестерона и кортизола. Используйте пипетку и вакуумного аспиратора для ускорения испарения этанола: (используйте 5 мл stripette сломанный пополам и положите на полпути вниз в трубу быть очень осторожными, чтобы не аспирата EtOH жидкости Держите пипетку надежно фиксироваться Kimwipes а затем принести чаевые. до 500 мкл марка находится на стороне трубки.
2. Добавить последующие аликвоты в порядке их появления на графике выше.
3. После того инсулина, что делает облачно раствор, добавить 20 мкл 1 н NaOH для нейтрализации рН. Sol'n должно идти от желтого до розового и сразу ясно. Кроме того, после того трансферрина, сразу же добавить 20 мкл 1 н NaOH, чтобы нейтрализовать рН и предотвратить образование осадков.
4. Составить 10 мл в серологические пипетки и разделить на 5 порций (одна порция).
5. Магазин при -20 ° C.
6. Сделать 2 мая партий сразу.

Диссоциация СМИ

А. Папаин (за 1 флакон):

** Подготовка день покрытие прямо перед рассечение.

Ингредиент	Сумма </ STRONG>	(Заметки) Заключительный Конц.
Цистеин воды	7.8mL	1mM цистеина
Папаин	Варьируется (* 190μl за бутылку 44.0mg/ml)	20 ед / мл (400 единиц общего за 20 мл сумму sol'n)
H & B конц.	2 мл
Карбогена	95% О2 + 5% CO2
HCl 5N	10 мкл
0,5% Фенол красный	20 мкл	0,001%
Kynurenate 0.5M	10 мкл	(В 1N NaOH) 0,5 мм

1. Добавить папаин, чтобы цистеина воду.
2. Добавить H & B конц., Kynurenate, HCl, и фенол красный.
3. Фильтры в флаконе диссоциации (как описано в настройке направления) и подключиться к карбогена.
   

B. H & B концентрата (100 мл 5 раз):

Ингредиенты	МВт	Powder/50ml H 2 O	Конц. (М)	Комбинат (мл)	Заключительные Конц. (ММ)
NaCl	58,44	11,699 г	4	14,5	116
KCl	74,56	3,728 г	1	2,7	5,4
NaHCO 3	84,01	4,2 г	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 г	1	1	2
MgSO 4	120,38	6,019 г	1	0,5	1
ЭДТА (ED2-SS)	292	Sigma 5% (сделать 5g/100ml акций)	0,134	0,3722	0,5
Глюкоза	180	Sigma 45%	2,5	5	25
TC H 2 O				62,93

1. Комбинат сумм со склада решений.
2. Разделить на 4 мл аликвоты.
3. Добавить аликвоту в цистеин водой после добавления папаин.
   

С. Цистеин Вода (157.5ml из 1X):

Ингредиенты	МВт	Компоненты Порошок (мг)	H 2 O (мл)	Сток Конц. (ММ)	Комбинат (мл)	Заключительные Конц. (ММ)
CaCl 2	147,2	736	10	500	0,6	1,9 мм
Цистеин	121,7	(1.5)	24	20 мм (0,02 М)	10	1,27 мм (0.88)
TC воды					146,9

1. Обеспечения и поддержания фондовых sol'n 0,5 М CaCl2 при 4 ° С
2. Сделайте одно использование sol'n цистеина и в сочетании с другими ингредиентами
3. Разделите на 10 аликвоты 15,75 мл и хранят при температуре 4 ° C
   

Подготовка GDNF

1. Алиготе приготовительная:
   1. Растворите стерильный, лиофилизированный гранул 5 мкг GDNF с 2.4mL стерильной деионизированной водой. Концентрация этого GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
   2. Распространение 2.08μg/mL GDNF sol'n в 76.9μl аликвоты в стерильные криопробирки. Это = 160ng одном флаконе.
   3. Хранить при -20 ° C.
2. Дополнение к культурам:
   1. Оттепель 1 аликвоту на каждые 8 ​​блюд.
   2. Развести аликвоту, добавив 723.1μl нейронов СМИ / аликвоту. Это сделает sol'n из 160ng/800μl GDNF.
   3. Добавить 100 мкл этого sol'n в 2 мл среды в каждое блюдо для конечной концентрации 10ng GDNF на мл.
      

Подготовка FDU

FDU-sol'n 1000X складе:

Ингредиент	Количество	(Заметки) Заключительный Конц.
Уридина	247 мг	16,5 мг / мл
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine)	100 мг (флакон)	6,7 мг / мл
TC воды	15 мл

1. Сделать чуть более 15 мл 16,5 мг / мл уридина.
2. Добавьте 15 мл уридина sol'n до 100 мг бутылка FDU сделать 6,7 мг / мл sol'n FDU.
3. Разделить на 200 мкл аликвоты и заморозить в -20 ° C.

Развести по применению:

1. Подавляют рост не-нервных клеток. Развести 1000X 1:10 акции путем добавления 200 мкл акции до 1,8 мл MEM.
2. Добавить 20 мкл разбавленного FDU к внешнему кольцу каждого блюда. Изменение пипетки советы часто. Накрыть крышкой и вернуться в инкубаторе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Методы, описанные здесь, позволяют высоким разрешением морфологических и нейрохимических функций центральных нейронов допамина, которые иначе недоступны в системном или в естественных условиях подход.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы