Для начала промойте культивируемые ИПСК с помощью PBS или DPBS от Dulbecco. И добавьте по одному миллилитру протеолитической и коллагенолитической смеси. Инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут, чтобы отделить ячейки.
Затем добавьте 1,5 миллилитра предварительно подогретой питательной среды iPSC, чтобы остановить реакцию. Диссоциируйте клетки из чашки для культивирования клеток, пипеткой вверх и вниз от семи до 10 раз, чтобы получить одноклеточную суспензию. Перенесите клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.
Гранулируйте ячейки при 200xg в течение пяти минут при комнатной температуре. И аспирировать надосадочную жидкость. Ресуспендируют гранулу в двух миллилитрах питательной среды iPSC, дополненной 50 микромолярным Y27632.
Теперь используйте 10 микролитров клеточной суспензии для подсчета клеток с помощью камеры Нейбауэра. Отрегулируйте концентрацию клеточной суспензии до 9 000 клеток на 150 микролитров, используя питательную среду iPSC с добавлением 50 микромоляров Y27632. Чтобы генерировать эмбриоидные тела или ЭБ, встряхните клеточную суспензионную трубку, чтобы предотвратить клеточное осаждение, прежде чем засевывать 150 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины со сверхнизким прикреплением.
Культивируют ЭБ в умуминированной атмосфере в течение 48 часов. По окончании инкубации удаляют по 100 микролитров среды на лунку. И добавьте 150 микролитров предварительно подогретой свежей среды без Y27632.
Создайте сетку с ямочками четыре на четыре на парапленке, поместив сетку из парапленки на стойку для трубок объемом 0,2 миллилитра стороной вверх, обернутой бумагой. И аккуратно прижмите палец в перчатке к каждому отверстию стойки, чтобы встроить ЭБ в матрицу базальной мембраны. Затем удалите бумагу и вырежьте ямочек из квадрата парапленки ножницами, чтобы отрегулировать его размер, чтобы он поместился в 60-миллилитровую чашку для культивирования клеток.
Поместите парапленку с ямочками обратно на стойку для трубок объемом 0,2 миллилитра, чтобы обеспечить основу для генерации капель матрицы базальной мембраны. Осторожно перенесите ЭБ один за другим из лунки чашки для культивирования в ямочки парапленки с помощью пипетки с отрезанным наконечником пипетки объемом 200 микролитров. Переместив 16 ЭБ в сетку, возьмите новый наконечник пипетки объемом 200 микролитров и удалите оставшуюся среду из ямочек.
Теперь нанесите пипеткой одну каплю матрицы базальной мембраны на каждую ямочку, содержащую одну ЭБ. Возьмите наконечник пипетки объемом 10 микролитров и быстро переместите ЭБ в центр каждой капли, не нарушая границ капель. Поместите парапленку с ямочками с каплями матрицы базальной мембраны в 60-миллиметровую чашку для культивирования клеток. И инкубируйте от 15 до 30 минут при 37 градусах Цельсия, чтобы матрица полимеризовалась.
Кроме того, чтобы отделить встроенные в матрицу ЭБ от парапленки, добавьте в чашку пять миллилитров дифференцировочной среды без витамина А. И переверните квадрат парапленки вверх дном с помощью щипцов так, чтобы сторона с ЭБ была обращена ко дну посуды. Осторожно встряхните чашку, чтобы отделить капли матрицы базальной мембраны, содержащие ЭБ, от парапленки.
Если некоторые из них все еще прикреплены, возьмите край квадрата парапленки с помощью щипцов и быстро сверните его к центру чашки несколько раз. Затем культивируют церебральные органоиды на орбитальном шейкере при 55 об/мин в увлажненной атмосфере с 5% углекислого газа и 95% воздуха при 37 градусах Цельсия. Держите органоиды в СД без витамина А со средней заменой через день.
Показано светлопольное изображение 32-дневного мозгового органоида человека после посева с желудочкоподобными структурами на периферии и компактной, здоровой морфологией.
