Чтобы начать визуализацию трансфицированных клеток HeLa, выберите достаточно длительное время экспозиции для отдельных каналов флуоресценции в режиме просмотра в реальном времени на основе гистограмм интенсивности, генерируемых программным обеспечением для визуализации. Установите соответствующее количество плоскостей для визуализации по оси Z. Выберите соответствующее количество полей обзора для каждой скважины.
Чтобы начать количественный анализ полученных изображений, выполните коррекцию фона для всех изображений из всех каналов флуоресценции. В зависимости от размера анализируемых объектов выберите соответствующий размер фильтра. Далее приступаем к сегментации изображения, создавая маску основного объекта на основе отношения интенсивности флуоресцентного сигнала к фону для канала, соответствующего ядрам клетки.
Создавайте маски для субобъектов, представляющих BrdU и пятна митохондриальной ДНК, используя флуоресцентные каналы, подходящие для данных структур. Установите параметры и измерьте интенсивность отдельных пикселей в каждой маске для всех каналов флуоресценции. Чтобы получить общую интенсивность флуоресценции для BrdU или канала митохондриальной ДНК, суммируйте интенсивности всех субобъектов, назначенных данному ядру клетки.
Чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции, разделите общую интенсивность флуоресценции на сумму площади подобъектов, назначенных данному ядру клетки. Результаты визуализации были проверены путем измерения уровней митохондриальной ДНК и экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Лечение дидезоксицитидином или DDC привело к очень сильному снижению уровня митохондриальной ДНК.
Более слабый эффект наблюдался при сайленсинге геликаз TFAM и TWINKLE, в то время как трансфекция клеток митохондриальной ДНК-полимеразой гамма или миРНК POLG оказывала умеренное влияние на количество копий митохондриальной ДНК. Количественная оценка экспрессии геликаз TFAM и TWINKLE подтвердила эффективное снижение экспрессии их мРНК примерно до 15-20% от контрольных уровней. В POLG экспрессия мРНК была снижена только до 30%, что объясняет неожиданное скромное влияние на количество копий митохондриальной ДНК.
