JoVE Journal

Biochemistry

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove

Addition of Primary and Secondary Antibodies to the Transfected HeLa Cells to Monitor the mtDNA Distribution

Транскрипт

Чтобы начать добавление первичного антитела, аспирируйте бычий сывороточный альбумин или BSA из фиксированных и заблокированных трансфицированных клеток HeLa, оставляя 10 микролитров раствора BSA в лунке. Затем добавьте 10 микролитров раствора первичного антитела, приготовленного в 3% BSA в PBS, и инкубируйте планшет в темноте при четырех градусах Цельсия в течение ночи. После инкубации промыть каждую лунку четыре раза 100 микролитрами PBS, оставив 10 микролитров после последней стирки.

Затем добавьте 10 микролитров раствора вторичных антител в 384-луночную пластину. Используйте изотип-специфические антитела, конъюгированные с флуорохромами, такие как Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 555. После инкубации пластины в темноте в течение одного часа промойте каждую лунку четыре раза 100 микролитрами PBS и оставьте 50 микролитров PBS в лунке после последней стирки.

Использование анти-ДНК-антител позволило контролировать распределение митохондриальной ДНК в клетке в данных экспериментальных условиях. Подавление митохондриального транскрипционного фактора A TFAM привело к резким изменениям в распределении митохондриальной ДНК с меньшим количеством митохондриальных пятен ДНК, чем в контрольных клетках. Количественная оценка среднего флуоресцентного сигнала от антитела против ДНК показала увеличение в несколько раз при подавлении TFAM по сравнению с другими тестируемыми условиями.

Смотреть дополнительные видео

Мы используем файлы cookie для улучшения качества работы на нашем веб-сайте.

Продолжая пользоваться нашим веб-сайтом или нажимая кнопку «Продолжить», вы соглашаетесь принять наши файлы cookie.

Подробнее