Чтобы выполнить южное блоттинг, начните с разрезания нейлоновой мембраны на сегмент размером 10 на 12 сантиметров. Сделайте насечку в том же положении, что и гель. Активируйте мембрану, окунув ее в дистиллированную воду, а затем 20-кратный буфер с солевым цитратом натрия.
Поместите фитиль фильтровальной бумаги на двойной перевернутый противень, установите так, чтобы концы касались основания внешнего лотка. Нанесите гель на фильтровальную бумагу. Затем поместите активированную нейлоновую мембрану поверх геля, убедившись, что насечки перекрываются.
Удалите пузырьки воздуха стеклянной палочкой. Поместите двухсантиметровую кучу целлюлозной фильтровальной бумаги размером 9,5 на 11,5 сантиметра и еще шесть сантиметров обычной фильтровальной бумаги. Поместите груз поверх установки для равномерного распределения веса.
Заполните внешний лоток 20-кратным буфером с солевым цитратом натрия и оставьте его на ночь для эффективного переноса. После южного переноса зафиксируйте перенесенную ДНК на мембране с помощью УФ-сшивания на УФ-трансиллюминаторе. Дважды промойте мембрану 25 миллилитрами 2-кратного буфера с солевым цитратом натрия.
Чтобы выполнить гибридизацию, инкубируйте мембрану в 10 миллилитрах предварительно подогретого буфера для предварительной гибридизации. Осторожно перемешивайте мембрану вручную через частые промежутки времени. Затем инкубируйте кляксу в 10 миллилитрах гибридизационного буфера при температуре 42 градуса Цельсия в течение трех часов при осторожном перемешивании.
Промойте кляксу дважды в 25 миллилитрах жесткого буфера в течение 10 минут при комнатной температуре при легком перемешивании. Теперь дважды промойте кляксу в 25 миллилитрах предварительно подогретого жесткого буфера при температуре 50 градусов Цельсия в течение 15 минут при легком перемешивании. Смойте 15 миллилитрами буфера для стирки в течение пяти минут при легком перемешивании при комнатной температуре.
Инкубировать мембрану в 10 миллилитрах свежеприготовленного блокирующего раствора в течение 30 минут при комнатной температуре при легком перемешивании. Затем поместите его в 10 миллилитров антидигоксигенина, конъюгированного с рабочим раствором щелочной фосфатазы. Дважды промойте кляксу в буфере для стирки при комнатной температуре в течение 15 минут.
Теперь инкубируйте в 10 миллилитрах детектирующего буфера в течение пяти минут при комнатной температуре. После удаления лишнего буфера поместите мембрану на ацетатный лист стороной ДНК вверх. Добавьте примерно от одного до 1,5 миллилитров раствора субстрата по каплям на мембрану.
Сразу же положите на него еще один лист ацетата и выдерживайте пять минут при комнатной температуре. Перед визуализацией отожмите излишки раствора субстрата. Используя систему визуализации гелевой документации, соберите несколько ненасыщенных изображений в разные моменты времени для анализа.
После южного блоттинга и гибридизации были отчетливо видны фрагменты рестрикции теломер, на что указывает мазок.
