Начните с добавления 500 микролитров буфера для лизиса к ранее полученной клеточной грануле A2780 и аккуратно перемешайте, используя отрезанный наконечник с минимальным диаметром отверстия два миллиметра. Добавьте 20 мкг на миллилитр свежеприготовленной РНКазы и перемешайте путем мягкой инверсии. Инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
В конце инкубации добавьте протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг на миллилитр и аккуратно переверните 10 раз. Снова инкубируйте при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа, переворачивая пробирку каждые 10 минут. Пипеткой наберите 500 микролитров реагента фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в пробирку и аккуратно переверните пробирку около 20 раз.
Центрифугируют его при 9 391 G в течение 15 минут при комнатной температуре. Пипеткой поместите верхний водный вязкий слой в новую трубку. Добавьте равный объем хлороформа и перемешайте путем легкой инверсии.
После однократного центрифугирования пробирки соберите водный слой. Добавьте соответствующее количество пяти моляров хлорида натрия в пробирку, чтобы увеличить концентрацию на 0,2 моль. Добавьте два объема 100% этанола в тюбик и аккуратно переверните его 20 раз.
Центрифугу при 15, 871 G в течение пяти минут при комнатной температуре. После отказа от надосадочной жидкости добавьте 500 микролитров 70%-ного этанола. Снова центрифугу в том же состоянии, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
После того, как гранула высохнет на воздухе, добавьте 50 микролитров стерильной воды, не содержащей нуклеаз, и дайте ей регидратироваться. Затем смешайте ДНК пипеткой с помощью отрезанного кончика. Используйте УФ-спектрофотометрию для измерения концентрации ДНК.
После переваривания ДНК отделите ее, используя 0,8% агарозы. Погрузите агарозный гель в 0,25 молярного раствора соляной кислоты на 10 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Затем дважды смойте гель дистиллированной водой.
Чтобы денатурировать ДНК, погрузите гель в раствор гидроксида натрия и хлорида натрия. Затем дважды смойте гель дистиллированной водой. Чтобы нейтрализовать ДНК, как показано на рисунке, погрузите гель в раствор 0,5 молярной соляной кислоты и трех моляров хлорида натрия при рН семь.
Экстракторная геномная ДНК показала хорошую целостность, что указывает на ее использование для дальнейшей последующей обработки фрагментов рестрикции теломер.
