Перед мультиплексным иммунофлуоресцентным окрашиванием фиксируют ткань и проводят депарафинизацию и ингибирование эндогенной пероксидазы. Затем для мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания погружают предметные стекла в 300-миллилитровую банку для окрашивания, содержащую 10-миллимолярный цитратный буфер с добавлением 0,1% Triton X-100. Поместите банку для окрашивания с закрытой крышкой в микроволновую печь на три-пять минут на максимальной мощности, пока буфер не закипит.
После закипания оставьте буфер при температуре около кипения, поставив микроволновую печь на слабую мощность на 15 минут. Снова нагрейте буфер, поставив микроволновую печь на максимальную мощность на 90 секунд. Достаньте банку из микроволновой печи и дайте буферу остыть в течение 15 минут при комнатной температуре.
Промойте предметные стекла три раза в течение пяти минут каждое в дистиллированной воде, а затем пять минут ополаскивания в физиологическом растворе с трис-буфером, содержащем 0,1% Tween 20 или TBS Tween. После последней стирки снимите TBS Tween, промокнув предметные стекла на бумажном полотенце. Затем поместите предметные стекла на предметное стекло микроскопа и обведите ткань гидрофобной ручкой.
Блокируйте неспецифические сайты связывания, покрывая ткань 5% BSA, растворенным в TBS Tween. Через 30 минут снимите блокирующий буфер, промокнув предметные стекла на бумажном полотенце. Затем инкубируйте ткань в течение 60 минут с 300 микролитрами первичного антитела, разведенного в 1% BSA, TBS Tween.
После инкубации промойте предметные стекла три раза по три минуты с помощью TBS Tween. После промывания инкубируйте ткань в течение 40 минут с 300 микролитрами вторичного антитела Poly-HRP. После инкубации промойте предметные стекла три раза по три минуты с помощью TBS Tween.
Затем инкубируйте ткань в течение 10 минут с 300 микролитрами реагента на основе флуорохрома тирамида, разведенного в 200 раз в боратном буфере, импровизированном с добавлением 0,003% перекиси водорода. Затем трижды промойте предметные стекла с помощью TBS Tween и инкубируйте ткань в течение ночи при четырех градусах Цельсия с человеческим пан-цитокератиновым антителом, разбавленным в 1% BSA, TBS Tween. На следующий день промойте ткань TBS Tween и инкубируйте в течение 120 минут с вторичным антителом, непосредственно соединенным с флуорохромом, разбавленным в 200 раз в 1% BSA, TBS Tween.
После инкубации промойте ткань TBS Tween перед окрашиванием ядер бисбензимидом, разведенным в 1,000 раз в 10% BSA, TBS Tween в течение пяти минут. Промойте ткань три раза в течение трех минут каждый в дистиллированной воде, прежде чем установить ее на предметное стекло, используя флуоресцентную монтажную среду и боросиликатное покровное стекло. Для анализа изображений импортируйте сканы в программное обеспечение для анализа изображений.
Затем перейдите на вкладку «Анализ» и выберите алгоритм флуоресценции с высоким плексом, нажав «Настройки», «Действия», а затем «Загрузить». Выберите вкладку «Выбор красителя» и интересующий краситель. На вкладке «Ядерное обнаружение» перейдите в раздел «Тип ядерной сегментации» и выберите «Пользовательский ИИ».
Затем в классификаторе ядерной сегментации выберите сохраненный обученный AI.In вкладке «Обнаружение мембраны и цитоплазмы», выберите максимальный радиус цитоплазмы и количество мембранных красителей. Для каждого красителя выберите ядерно-положительный порог, цитоплазмоположительный порог и мембраноположительный порог. Для каждого красителя выберите процент полноты ядра, мембраны и цитоплазмы.
Сохраните алгоритм, выбрав Параметры, Действия и Сохранить. Проанализируйте область интересов, нажав кнопку «Анализировать» и выбрав «Слой аннотаций». Затем перейдите на вкладку «Результаты» и выберите все данные в разделе «Данные объекта».
Экспортируйте данные в формате CSV, щелкнув правой кнопкой мыши «Экспорт» и выбрав objectdata.csv. Показан репрезентативный результат оптимального окрашивания методом мультиплексной иммунофлюоресценции. Выбор правильного разведения имел важное значение для проверки специфичности антител и оптимизации отношения сигнал/шум окрашивания.
