Для начала возьмите фрагменты ДНК дефицитной клетки, вытянутые биотином. Приготовьте мастер-смесь, добавив реагенты для хвоста dATP, и инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем инактивируйте экзо-минус Кленова, инкубировав образец в течение 10 минут при 65 градусах Цельсия и охладив его на льду.
После промывки шариков по 300 микролитров ТБ, НТБ и 100 микролитров лигирующего буфера ресуспендируют их в 50 микролитрах лигационного буфера. Добавьте в образец четыре микролитра 15-микромолярной предварительно отожженной переходной смеси и один микролитр 2000 единиц на микролитр ДНК-лигазы T4. Вымойте шарики 400 микролитрами ТБ, 200 микролитрами НТБ и 100 микролитрами буфера рестрикции два.
После амплификации библиотеки с помощью ПЦР объедините все 50 микролитровых реакций из одного и того же образца в 1,5-миллилитровую пробирку с низким связыванием ДНК. Поместите его на магнитную трубку и подождите, пока все бусины не прилипнут к стене. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку, в новую 1,5-миллилитровую пробирку с низким связыванием ДНК и долейте буфер TLE до 500 микролитров.
Чтобы выполнить двусторонний отбор с помощью парамагнитной очистки шариков, добавьте в библиотеку 200 микролитров бусин, смешайте вихревым способом и инкубируйте в течение 10 минут, вращая при комнатной температуре. Затем поместите библиотеку на магнит и подождите, пока все бусины не прилипнут к стене. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку, в новую 1,5-миллилитровую пробирку с низким связыванием ДНК.
Сконцентрируйте бусины, взяв 750 микролитров бусин и поместив их в 1,5-миллилитровую пробирку на магните. После того, как все бусины прилипнут к стене, удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте бусины, встряхнув 300 микролитров новых бусин. Добавьте в образец 300 микролитров концентрированных шариков.
Перемешивайте вихревом и выдерживайте 10 минут, вращая при комнатной температуре. Поместите на магнит. Дождитесь, пока все бусины прилипнут к стене и удалите надосадочную жидкость.
Вымойте шарики, добавив один миллилитр 70% этанола в трубку, при этом шарики все еще находятся на магните. Дайте шарикам высохнуть на воздухе и ресуспендируйте их в 21 микролитре буфера TLE путем вихреобразования. Чтобы разбавить библиотеку от бусин, инкубируйте образец в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия в термоблоке.
Поместите пробирку в магнит и перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку, в новую 1,5-миллилитровую пробирку с низким связыванием ДНК.
