С помощью свечи для яиц обведите карандашом по периметру воздушного кармана над эмбрионом Е14 или Е15 и заклейте очерченную область прозрачным скотчем. С помощью изогнутых или тонких ножниц аккуратно обрежьте прорисованный участок. Будьте осторожны, чтобы не врезаться в мембрану эмбриона или кровеносные сосуды.
Затем выбросьте верхний кусок скорлупы. После обезглавливания эмбриона цыпленка поместите голову в 10-сантиметровую посуду с холодным стерильным раствором CMF. Используя стерильные тонкие щипцы, снимите кожу, покрывающую мозг, чтобы обнажить лежащую в основе твердую мозговую оболочку.
Удалите формирующиеся кости черепа на левой и правой сторонах мозга. Формирующиеся кости черепа еще не покрывают большую часть мозга. Аккуратно используйте тонкие заостренные щипцы, чтобы разорвать мозговые оболочки, перекрывающие центр мозга, и очистить его с каждой стороны, чтобы открыть мозг.
Используя тонкие изогнутые щипцы, зачерпните мозг снизу вперед и осторожно вытащите его из полости. Рассеките мозг на три основные части: передний мозг, средний мозг или оптические текты и мозжечок. Удалите вышележащую мягкую мозговую оболочку из текты с помощью тонких щипцов и поместите рассеченные области мозга в небольшую стерильную посуду со льдом.
Для встраивания и разрезания мозга аккуратно возьмите либо оптический тектум, либо область переднего мозга изогнутыми щипцами в качестве мерной ложки и слегка промокните стерильную марлю, чтобы удалить лишнюю жидкость. Подготовьте простую форму, сформировав алюминиевую фольгу вокруг объекта соответствующего размера. Здесь в качестве объекта используется небольшой прямоугольный металлический вибрирующий блок для резки ткани.
Используйте стерильную пипетку для переноса и заполните форму агарозой с низким содержанием расплава. Быстро поместите область мозга в агарозу и дайте ей затвердеть в течение примерно четырех-пяти минут на льду. Вырежьте срезы на вибрирующем тканерезе с помощью сапфирового ножа.
Стерильным шпателем зачерпните и выньте ломтик из лотка. Аккуратно сдвиньте часть со шпателя на мембранный вкладыш с помощью другого стерильного шпателя. Поместите шестилуночную пластину с срезами мозга на мембранные вставки в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
На следующий день после нанесения покрытия используйте стерильную пипетку Пастера, чтобы аспирировать среду из-под вкладыша и добавить по одному миллилитру свежего среза в каждую лунку под мембранной вставкой. Затем, чтобы ввести клетки GBM на срезы мозга, удалите от одного до нескольких сфероидов из их чашки для культивирования с помощью микропипетки объемом 20 микролитров, установленной на пять микролитров. Аккуратно вытесните носитель со сфероидами на желаемый срез мозга и дайте сфероидам культивироваться на срезе в течение двух-пяти дней.
На этом рисунке показаны результаты жизнеспособности срезов тектума зрительного нерва x vivo после одной недели в культуре. Конфокальные изображения среза мозга, окрашенного на ядра бисбензимидом и иммуноокрашенного на ламинин, ясно показывают нормальные и неповрежденные кровеносные сосуды, оптически срезанные в различных конфигурациях. Здесь показано максимальное проекционное изображение конфокального Z-стека среза мозга, окрашенного на фактор транскрипции SOX2 и полные ядра бисбензимидом.
Эти результаты свидетельствуют о том, что срезы мозга куриного эмбриона могут культивироваться на мембранных вставках в течение примерно двух недель и оставаться жизнеспособными с нормальными кровеносными сосудами и экспрессией транскрипционного фактора.
