Начните с того, что положите принесенную в жертву беременную мышь на спину на доске для вскрытия. С помощью щипцов зажмите среднюю линию живота. Острыми ножницами разрежьте живот через кожу и брюшину от гениталий до грудной клетки по средней линии.
Удалите матку, содержащую эмбрионы, и немедленно поместите ее на лед. Аккуратно прорежьте желточный мешок с плацентарных сторон и извлеките эмбрионы. Затем поместите обезглавленные эмбриональные головы в чашку со льдом, содержащую дефицит кальция и магния.
Поместите голову в 35-миллиметровую посуду лицом влево. Проткните один глаз краем щипцов, другим крепко придерживая подбородок. Аккуратно разорвите кожу головы от затылка по средней линии по направлению к морде.
Используйте угловые щипцы, чтобы войти через белый овальный спинной мозг и расколоть череп вдоль средней линии, обнажив мозг. Аккуратно очистите череп от боков. Затем извлеките мозг из черепа и избавьтесь от черепа.
Используйте щипцы для удаления мозговых оболочек. Поместите мозг в бижутерию, содержащую два миллилитра кальция и магния с дефицитом HBSS. Добавьте 250 микролитров 10-кратного трипсина в бижутерию.
Тритуируйте мозги, встряхивая бижутерию, а затем инкубируйте в течение 15 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем добавьте два миллилитра ингибитора трипсина сои в каждую бижутерию. Встряхните, чтобы равномерно диспергировать ингибитор.
Без центрифугирования перелейте два миллилитра надосадочной жидкости из каждого бижутерии в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Используя иглу 19-го калибра, прикрепленную к пятимиллилитровому шприцу, дважды аспирируйте суспензию, чтобы тритировать оставшиеся клетки в бижутерии. Повторите аспирацию дважды иглой 21-го калибра.
Используя иглу 23-G, перенесите клетки из бижутерии в 15-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую надосадочную жидкость клетки, и центрифугу при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре. С помощью пятимиллиметровой серологической пипетки перенесите всю надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую центрифужную пробирку, не нарушая гранулы. Повторите центрифугирование.
Добавьте 10 миллилитров гальванической среды в пробирку, содержащую комбинированные гранулы с обеих стадий центрифугирования, и хорошо перемешайте, чтобы создать целую суспензию. Окрашивают клетки трипановым синим и подсчитывают с помощью гемоцитометра или счетчика клеток. Поместите клетки, добавив необходимый объем суспензии эмбриональных клеток мозга мыши E17 в луночную пластину.
Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия при температуре от 5 до 7% углекислого газа в течение двух-четырех часов. После удаления среды добавьте новую дифференциирующую среду в каждую лунку. Прижмите все плавающие накладки с помощью стерильного наконечника пипетки.
Поддерживайте культуры, удаляя часть надосадочной жидкости и заменяя ее свежими дифференцирующими средами три раза в неделю. Культуры визуализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием на NG2 и нестин в качестве маркеров развития, SMI31, MBP и NeuN в качестве нейрональных маркеров, а также CNP, GFAP и Iba1 в качестве глиальных маркеров. Исследования qRT-ПЦР инфицированных клеток показали повышение регуляции мРНК хемотаксисного цитокина Ccl5 в культурах, обработанных бета-интерфероном.
Исследования ИФА показали увеличение Ccl5 в надосадочной жидкости, тем самым демонстрируя корреляцию между экспрессией мРНК и белка. Проточные цитометрические исследования одноклеточной суспензии показали, что 70% клеток остаются жизнеспособными. Присутствовало большое количество микроглии, нейронов и астроцитов, в то время как олигодендроциты были наименее многочисленными.
