Для начала возьмите переваренный и расширенный архивный или свежий образец клинической ткани и приступайте к окрашиванию антителами, поместив его в одну лунку шестилуночного планшета для культивирования клеток. Промойте образец три раза PBS в течение 10 минут каждый при комнатной температуре. В зависимости от размера образца добавьте от 0,5 до 2 миллилитров первичных антител в окрашивающий буфер, чтобы обеспечить адекватное покрытие геля.
Инкубировать в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте образец три раза PBS по 10 минут каждый при комнатной температуре. Добавьте соответствующие вторичные антитела и инкубируйте в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия в выбранном буфере для окрашивания.
Повторно промойте образец, как было показано ранее, и добавьте от 1 до 2 миллилитров полиэтиленгликоля в образец в шестилуночной пластине. Окрашивайте образец конъюгированным эфиром NHS Fluor 4 в течение трех часов при комнатной температуре. По окончании инкубации трижды промойте образец PBS.
Далее для выполнения окрашивания липидов возьмите расширенный образец ткани, трижды промытый в PBS, нанесите обычный липофильный краситель, разведенный в 200 раз в 2 миллилитрах 0,1% Triton X-100 или PBS в течение 72-96 часов при комнатной температуре, и промойте не менее трех раз PBS. Для проведения FISH приготовьте гибридизационный буфер, смешав 2 x SSC, 10% сульфата декстрана, 20% этиленкарбоната и 0,1% Tween 20. Поместите гомогенизированные образцы геля в буфер для гибридизации, предварительно нагретый до 60 градусов Цельсия, в течение 30 минут.
Затем инкубируйте образцы геля с буфером для гибридизации, содержащим 10 пикомолярных зондов FISH против целевого гена в течение ночи при температуре 45 градусов Цельсия. Промойте образцы с помощью промывочного буфера строгости дважды по 15 минут при 45 градусах Цельсия и дважды по 10 минут при 37 градусах Цельсия. Промойте образец три раза с помощью PBS в течение 10 минут и продолжайте визуализацию или хранение образца в PBS плюс 0,02% азида натрия при 4 градусах Цельсия.
Чтобы полностью расширить и визуализировать ткань, переместите образцы, расширенные в четыре раза в PBS, на стеклянную дно-шестилуночную визуализирующую пластину. Если образец был расширен еще больше, разрежьте его на более мелкие кусочки. Нанесите 0,1% полилизина на поверхность стекла.
Поместите образец на предметное стекло и удалите излишки жидкости вокруг геля с помощью бумажной лабораторной салфетки, чтобы предотвратить движение геля во время визуализации. После этого выполните флуоресцентную визуализацию с помощью обычного широкоугольного микроскопа, конфокального микроскопа или другой системы визуализации по вашему выбору. После визуализации уменьшите образцы в PBS не менее чем за три 10-минутные промывки, так как длительное хранение в деионизированной воде приводит к ухудшению флуоресцентного сигнала.
Наконец, храните образцы в PBS с 0,02% азидом натрия при температуре 4 градуса Цельсия. Конфокальные изображения полностью расширенной ткани мозга мыши позволили визуализировать белки и структуры клеточных и митохондриальных мембран. Также были идентифицированы нуклеиновые кислоты формальной и встроенной в парафин ткани лимфатических узлов человека.
После 3,5-кратного расширения почечного участка был виден расширенный клубок без трещин. Однако недостаточное закрепление или гомогенизация приводили к растрескиванию, деформациям и потере помеченных мишеней в другом участке почки.
