Для начала инокулируйте 2 миллиона клеток pan02 в 12 миллилитров DMEM и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и влажности 95%, углекислом газе 5% и воздухе 35%. Через 48 часов центрифугируйте культуру при 28 г в течение 2 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Зафиксируйте клетки, добавив 1 миллилитр 2,5% глутаральдегида в 1,5-миллилитровые микроцентрифуги на ночь при температуре 4 градуса Цельсия.
На следующий день центрифугируйте образцы при 1006 г в течение пяти минут и отсасывайте фиксатор перед двукратной промывкой образца 0,1 моляра PBS. Впоследствии дважды промойте образцы двойной дистиллированной водой в течение 10 минут каждый. Далее добавьте 50 микролитров раствора 1%-го тетраоксида осмия и 1,5%-го ферроцианида калия в соотношении 1 к 1 и выдерживайте при температуре 4 градуса Цельсия в течение 1 часа.
Центрифугируйте и промойте образцы дважды 0,1 моляра PBS и один раз водой двойной дистилляции. Затем добавьте 1 миллилитр 1%-ного тиокарбогидразида и выдерживайте при комнатной температуре от 30 до 60 минут. После инкубации центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость перед 4-кратной промывкой образцов дважды дистиллированной водой.
Далее добавьте 50 микролитров 1%-ного тетраоксида осмия и дайте ему закрепиться при комнатной температуре в течение 1 часа. Снова центрифугируйте и 4 раза промойте образцы двойной дистиллированной водой. Добавьте 1 миллилитр 2%-ного уранилацетата и дайте ему покраситься до 4 градусов Цельсия в течение ночи.
После промывки образцов дважды дистиллированной водой добавьте 1 миллилитр раствора Уолтона и выдерживайте при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа. После инкубации клетки 4 раза промыть водой двойной дистилляции перед дегидратацией в сортированном этаноловом ряду по 10 минут каждая. Затем дважды обезвоживайте по одному миллилитру 100% ацетона по 10 минут каждый.
Далее смешайте 200 микролитров ацетона с эпоксидной смолой Pon 812 в соотношении 3 к 1, 1 к 1 и 1 к 3. И замочите образцы в смоле при комнатной температуре на 2, 4 и 4 часа соответственно После соответствующей инкубации пропитайте образцы на ночь 100% эпоксидной смолой Pon 812. На следующий день переложите образцы в плоскую форму для заделки и полимеризуйте их в печи при температуре 60 градусов Цельсия в течение 48 часов.
После полимеризации с помощью ультра микротома соберите серийно нарезанные полоски толщиной 70 нанометров на гидролизованных кремниевых пластинах и высушите их в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение 10 минут.
