Разрежьте проводящую углеродную ленту и приклейте ее между кремниевыми пластинами, установленными с секциями клеток поджелудочной железы и стадией образца SEM. Далее установите ускоряющее напряжение FESEM на два киловольта с рабочим расстоянием четыре миллиметра. В верхней строке меню нажмите на значок HL.
Затем, при малом увеличении, сориентируйте первую секцию целевого среза полосок, и, опять же, нажмите на значок HL, чтобы переключиться в режим большого увеличения. Соберите изображение, подходящее для интересующей структуры, регулируя яркость, контрастность и увеличение изображения. Затем выберите «Вид проекта», затем «Открыть данные» и импортируйте файлы изображений для анализа в программное обеспечение.
Выровняйте изображения, нажав на «Выровнять фрагменты» и «Редактировать». Затем в нижней левой строке меню отрегулируйте значение Диапазона интенсивности, изменив прозрачность изображения. Выберите модуль Извлечь подтом и щелкните выровненные наборы данных, чтобы они соответствовали размеру перекрывающейся части всего стека.
Затем в подразделе сегментации выберите Повторная выборка, затем Сегментация и нажмите Сохранить. Далее, выберите порог Волшебной палочки и размер инструмента Кисть (Brush Tool), чтобы выбрать правильный диапазон. В меню «Выделение» нажмите на значок «Добавить», чтобы добавить выбранную область.
После завершения региональной сегментации сгенерируйте файл изображения, следующий за наилучшими результатами по размеру объекта и разрешению изображения. Нажмите на Crop Editor, и в поле Virtual Slider введите цифру шесть. Затем в левом выпадающем меню щелкните правой кнопкой мыши серую область под подразделом «Проект» и выберите «Создать поверхность», затем «Создать и применить».
В сгенерированном файле с помощью модуля «Вид поверхности» создайте структуру поверхности и 3D-представление. Изображения 2D FESEM показывают, что в контрольной группе митохондрии были равномерно распределены с регулярными структурами кристаллов. Напротив, в группе RSL3 наблюдались укороченные митохондрии с повышенной плотностью мембран и расплывчатыми структурами кристаллов.
Тем не менее, не все митохондриальные кристаллы дегенерировали в группе RSL3, так как некоторые остались нетронутыми. По сравнению с группой RSL3, группа ингибиторов имела в основном неповрежденные структуры кристаллов, и лишь некоторые из них не были заметны. 3D-изображения контрольной группы обеспечили более точное представление о митохондриях и их кристаллических структурах.
На 3D-изображениях группы RSL3 были обнаружены неправильные и вакуолированные митохондрии, в то время как группа ингибиторов демонстрировала различные формы кристаллов. Количественная оценка митохондриальных изменений показала, что в группе RSL3 значительно уменьшилась длина и объем митохондрий по сравнению с контрольной группой, в то время как группа ингибиторов показала промежуточные результаты. RSL3 также вызывал митохондриальную дисфункцию и изменял клеточный метаболизм, изменяя морфологию митохондрий и вызывая ферроптоз.
