Для начала поддерживайте клетки в колбе для культур площадью 75 квадратных сантиметров. Отсадите питательную среду и промойте клетки PBS без кальция и магния. Затем добавьте два миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА для отделения клеток адгезии.
Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре и повторно суспендировать клетки в 10 миллилитрах среды. Далее соберите клетки из колбы в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Центрифугируйте при 480 G в течение пяти минут при комнатной температуре и аспирируйте среду.
Ресуспендируйте клетки в 5-10 миллилитрах среды в зависимости от исходного слияния культуры. Удалите 100 микролитров клеток и добавьте в 1,5-миллилитровую пробирку со 100 микролитрами 0,4%-ного трипанового синего цвета. Добавьте клетки в гемоцитометр и подсчитайте их, наблюдая под микроскопом и используя ручной счетчик.
Разведите клетки до трех раз по 10 до четвертой клетки на миллилитр в культуральной среде без фенолового красного. Добавьте по 2,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета с покрытием из поли-D-лизина в соответствии с указаниями производителя. Выращивайте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненном инкубаторе, чтобы обеспечить прикрепление клеток к покровному стеклу.
На следующий день исследуйте прикрепление клеток под инвертированным микроскопом с помощью объектива 20X. Приготовьте исходные растворы для обработки в желаемых концентрациях и создайте контроль только для среды, контроль только для транспортного средства в концентрации, соответствующей исследуемому составу, и контроль с ионофором FCCP и исследуемыми соединениями. Работая с одним покровным листом за раз, добавляйте в клетки по 1,8 миллилитра среды для исследуемого состояния.
Инкубируйте клетки, обработанные контрольным или тестовым соединением, при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа во влажной среде в течение желаемого времени. По истечении периода лечения добавьте в клетки 200 микролитров 10X TMRE. Инкубируйте от 15 до 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в среде, увлажненной углекислым газом 5%.
Аккуратно отсадите среду и дважды промойте клетки PBS, чтобы свести к минимуму фоновые помехи. Затем переверните крышку на предметное стекло микроскопа с маркировкой условий лечения. Представьте себе: клетки живут при возбуждении 549 нанометров и излучении 575 нанометров.
Используйте конфокальный микроскоп для захвата нескольких полей Z-стека с высокой скоростью захвата изображений до того, как целостность клетки будет потеряна. Сохраните и сохраните файл изображения для последующего анализа. Клетки с активными митохондриями сохранили окрашивание TMRE и показали высокую флуоресценцию.
Деполяризованные или неактивные митохондрии имеют сниженный мембранный потенциал, не могут удерживать TMRE и демонстрируют низкий флуоресцентный сигнал.
