После клонирования везикулярного нуклеирующего пептида, или метки последовательности VNP, на аминоконце гибридного белка культивируйте пятимиллилитровый бульон лизогении, или LB-закваски, из свежих бактериальных превращений при 37 градусах Цельсия до насыщения. Затем используйте его для инокуляции 25 миллилитров потрясающего бульона, или туберкулеза, содержащего соответствующий выбор антибиотика, в 500-миллилитровую коническую колбу. Инкубируйте колбу в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту или больше, чем равна 25-миллиметровому орбитальному броску, пока культура не достигнет значения оптической плотности 600 нанометров, или OD 600, от 0,8 до 1,0.
Затем индуцируйте экспрессию рекомбинантного белка из промотора Т7 путем добавления IPTG до конечной концентрации до 20 микрограммов на миллилитр или 84 микромоляра. Дав достаточно времени для индукции, гранулируйте клетки центрифугированием при 3000 G при 4 градусах Цельсия в течение 20 минут. Пропустите надосадочную жидкость через стерильный фильтр PES 0,45 микрона, не содержащий моющих средств, чтобы стерилизовать везикулы, содержащие среду, для длительного хранения.
Чтобы сконцентрировать везикулы в меньшем объеме, пропустите стерильные везикулы, содержащие среды, через стерильный фильтр MCE размером 0,1 микрона, не содержащий моющих средств. Затем аккуратно промойте мембрану от 0,5 до 1 миллилитра стерильного фосфатно-солевого буфера или PBS и используйте скребок для клеток или пластиковый разбрасыватель для тщательного удаления пузырьков с мембраны. Переложите концентрат везикулы в свежую микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки.
Очищенные пузырьки можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия. Ультразвуком обрабатывайте белок, содержащий везикулы, в стерильной среде, используя соответствующий график, чтобы разрушить везикулярные липидные мембраны и высвободить белок. Центрифугируйте ультразвуковую суспензию при 39 000 G и 4 градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы удалить везикулярный мусор.
BL21DE3 Escherichia coli, содержащая конструкт экспрессии VNp6-mNeongreen, демонстрировала флуоресценцию mNeongreen, индуцированную в течение ночи с помощью IPTG. Флуоресценция оставалась видимой в культуре после удаления бактериальных клеток центрифугированием. Наличие VNp-mNeongreen в культуре в очищенных питательных средах было подтверждено методом электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия.
Ресуспендированные очищенные везикулы в PBS также проявляли флуоресценцию.
