Чтобы выполнить визуализацию живых клеток мозга личинок третьего возраста, начните со сбора расчлененного мозга и изолированных жировых тел в последней лунке трехлуночной чашки для вскрытия, содержащей среду для вскрытия и визуализации. Поместите газопроницаемую мембрану на заднюю часть предметного стекла и прижмите разъемное кольцо к центру. С помощью микропипетки объемом 200 микролитров перенесите до 10 рассеченных мозгов с максимально возможным количеством жировых тел и от 130 до 140 микролитров среды на центр мембраны.
Сориентируйте мозг в соответствии с популяцией нервных стволовых клеток, которые необходимо визуализировать, и типом микроскопа, убедившись, что образцы находятся близко к объективу микроскопа. Например, чтобы получить изображение нейральных стволовых клеток в центральных долях мозга, убедитесь, что доли мозга находятся ближе всего к объекту. Затем аккуратно наденьте стеклянную крышку на раствор на мембрану, чтобы распределить раствор с мозгом и жировыми телами по всей мембране.
Держите лабораторную ткань за край защитного стекла, чтобы промокать избыток раствора до тех пор, пока мозг не коснется защитного стекла, не раздавливая. Далее обездвижите покровное стекло, нанеся расплавленный вазелин по его краям с помощью кисти, и дайте желе застыть. Добавьте 400 микролитров среды для визуализации в лунку в многолуночном микропредметном стекле.
Переложите в эту лунку предварительно рассеченные жировые тела. Затем поместите до 10 мозгов в кластер недалеко от центра колодца. Сориентируйте мозг в соответствии с популяцией нейральных стволовых клеток, которые необходимо визуализировать, и типом микроскопа.
Дайте мозгу осесть в лунке на две-пять минут. Накройте микропредметное стекло крышкой предметного стекла перед тем, как перенести его в микроскоп. Начните процесс сканирования, используя минимальную мощность лазера и время экспозиции, чтобы свести к минимуму обесцвечивание фотографий.
Визуализация мозга личинок, экспрессирующих БАС Cherry-Jupiter и андрогинно помеченных булавок GFP с использованием многолуночных слайдов и без добавок с жировыми телами, показала, что кегли образовывали выраженный апикальный полумесяц в делящихся нейробластах, к которому митотические веретена последовательно выравнивались во время митоза. В этих образцах длина клеточного цикла увеличивалась с увеличением времени визуализации. Образцы, которые были визуализированы в среде, дополненной жировым телом, на предметном стекле, связанном с мембраной, не показали увеличения длины клеточного цикла.
Кроме того, нейробласты с четырьмя делениями наблюдались на 10-часовом предметном стекле, связанном с мембраной.
