Для начала возьмите предварительно установленную 24-луночную культуральную пластину и поместите в каждую лунку стеклянную крышку. Затем добавьте 800 микролитров питательной среды, содержащей 10% FBS и DMEM. После регулировки концентрации клеток.
Инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Затем выбросьте питательную среду и промойте клетки PBS. Суспендируйте клетки в 800 микролитрах индукционной среды DMEM, содержащей BSA.
Растворите линолевую кислоту в безводном этаноле для приготовления стандартного раствора в концентрации 100 миллимоляров на литр. Добавьте линолевую кислоту в возрастающем градиенте на тарелку и повторите это четыре раза. Затем инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов.
По окончании инкубации удалите питательную среду и трижды промойте клетки PBS. Зафиксируйте их 400 микролитрами 4%-ного параформного альдегида на 20 минут. Затем выбросьте фиксирующий раствор и промойте их еще раз.
Инкубируйте клетки с 60% изопропиловым спиртом в течение пяти минут, затем выбросьте его. Добавьте свежеприготовленное масло красного O рабочего раствора и выбросьте его через 20 – 30 минут. Промойте клетки PBS от двух до пяти раз, пока не будут удалены излишки раствора красителя.
Окрашивайте ядро 300 микролитрами раствора гематоксилина на одну-две минуты. Затем сбросить раствор красителя и снова промыть их. Снимите стеклозащитный листок с промытой пластины PBS и поместите ее ячейками вниз на микроскопическое предметное стекло, содержащее 10 микролитров таблетированного герметика.
Чтобы измерить размер и количество ЛД, последовательно включите переключатель компьютера и микроскопа и поместите предметное стекло на загрузочную платформу. Затем откройте программное обеспечение для анализа изображений. Найдите изображения с низким энергопотреблением и капните соответствующее количество кедрового масла на предметное стекло.
Постепенно отрегулируйте объектив 200x и отрегулируйте поле зрения, пока не будет найдено четкое изображение. Затем захватывайте снимки из нужных областей и сохраняйте их. Случайным образом выберите 60 LD для каждого изображения и измерьте диаметр.
Экспортируйте результаты измерений в таблицу, чтобы проанализировать средний размер LD и коэффициент распределения. Окрашенные клетки гепатоцитов показали различные размеры и количество ЛД. При различных концентрациях линолевой кислоты обрабатывают.
Количество LD на клетку отрицательно коррелировало с различными концентрациями линолевой кислоты. Медиана числа LD на клетку составила 136 для группы, обработанной линолевой кислотой с концентрацией 100 микромоляров на литр, и снижалась при высоких концентрациях. Средний диаметр ЛД в контрольной группе составил 0,72 мкм, который увеличивался с увеличением концентрации в группе, обработанной линолевой кислотой.
Высокая концентрация линолевой кислоты увеличивала долю больших ЛД и уменьшала малые ЛД.
