Начните с подготовки всех реагентов перед экспериментом и разморозьте матрицу базальной мембраны на льду. Затем готовят мышиную монослойную среду. Разбавьте талую базальную мембрану один к 20 холодной мышиной монослойной средой, и держите ее на льду.
Поместите прозрачный вкладыш для клеточной культуры размером 0,4 микрометра с помощью стерильных щипцов в одну лунку 24-луночного планшета для культуры тканей. Возьмитесь за угловой зубец вставки и перенесите его в лунку. Повторяйте до тех пор, пока не будет доступно соответствующее количество вставок для культивирования клеточных культур.
Чтобы покрыть апикальную поверхность каждой вставки для клеточной культуры разбавленной матрицей базальной мембраны, поместите наконечник пипетки P 200 в центр вкладыша и вытолкните 150 микролитров матрицы. Затем перенесите планшет в стерильный инкубатор с температурой 37 градусов с 5% углекислым газом, по крайней мере, на один час. В конце инкубации поверните 24-луночную пластину под углом 45 градусов.
Положите один палец на угол зубца, чтобы стабилизировать вставку. Аккуратно поместите наконечник пипетки P 200 вдоль нижней стороны вкладыша и снимите матрицу основания. Удалите излишки, промыв каждый вкладыш для клеточных культур 150 микролитрами стерильных DPBS без ионов кальция или магния, и дайте им высохнуть в шкафу биологической безопасности в течение как минимум 10 минут.
После того, как вкладыши высохнут, добавьте 400 микролитров мышиной монослойной среды на дно и 75 микролитров поверх вкладыша для клеточной культуры. Повторяйте до тех пор, пока все вставки для клеточных культур не будут погружены. Оставьте тарелку в шкафу биологической безопасности или инкубаторе до тех пор, пока она не понадобится.
Затем извлеките из инкубатора 24-луночную пластину со зрелыми кишечными колоноидами и поместите ее под шкаф биологической безопасности. Отсадите среду с помощью стерильных наконечников и промойте каждую лунку одним миллилитром стерильного DPBS при комнатной температуре. С помощью стерильных наконечников удалите DPBS без ионов кальция или магния.
Расщепите каждую пробку матрицы базальной мембраны, добавив 500 микролитров ферментативного диссоциативного реагента в каждую лунку, которую необходимо пройти. Чтобы разбить пробку, поверните 24-луночную пластину под углом 45 градусов. Поместите кончик пипетки на край пробки и аккуратно вытащите его, пипетируя каждую пробку примерно от шести до 10 раз.
Поместите планшет на 24 лунки обратно в стерильный инкубатор при температуре 37 градусов с 5% углекислым газом на три-четыре минуты. После инкубации пипеткой внесите трипсин вверх и вниз пять-семь раз для каждой лунки под шкафом биологической безопасности. Переложите диссоциированные колоноиды из каждой лунки в стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров и доведите до объема 10 миллилитров с помощью ледяного средства для мытья мыши.
Затем центрифугируйте частично переваренные колоноиды при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия в центрифуге с качающимся ведром. Под шкафом биологической безопасности удалите надосадочную жидкость из гранулы с помощью пипетки объемом 10 миллилитров. Кроме того, удалите остатки среды с помощью пипетки P 200.
Затем повторно суспендируйте колоноидную гранулу, добавив 75 микролитров мышиной монослойной среды. Нанесите 75 микролитров колоноидной суспензии в центр каждой вставки для клеточной культуры. Осторожно пипетируйте суспензию один или два раза перед добавлением в лунку, чтобы обеспечить равномерное покрытие.
Поместите 24-луночный планшет со вставками для клеточных культур на вращающуюся платформу на 10 минут, чтобы обеспечить равномерное диспергирование по вкладышу для клеточной культуры, прежде чем поместить планшет в стерильный инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации вытесняют неприкрепленные фрагменты колоноидов, помещая наконечник рядом с внутренней частью клеточной культуры и пипетируя среду от трех до пяти раз с помощью пипетки P 200. Избегайте нарушения прикрепленных клеток кишечника.
Немедленно удалите смесь из среды и колоноидов. Повторяйте до тех пор, пока не будут очищены все вставки для клеточных культур. Теперь добавьте 150 микролитров предварительно подогретой мышиной монослойной среды на апикальную сторону каждой вставки для клеточной культуры.
Добавьте 400 микролитров подогретой мышиной монослойной среды в каждую лунку новой 24-луночной пластины. Перенесите вставку для клеточной культуры на новую пластину, захватив ее зубец с помощью стерильных щипцов. Меняйте среду через день до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое слияние.
Ферментативно разрушенные колоноиды, нанесенные на вставки клеточных культур, первоначально появлялись в клеточных кластерах в диапазоне от 15 до 150 клеток. На третий день клетки сплющивались и медленно покрывали вставку клеточной культуры, в основном достигая слияния. В течение следующих нескольких дней монослои продолжали расти и образовывали сплошной барьер, который можно количественно измерить.
