После клонирования гена, представляющего интерес в аденоассоциированной ITR-содержащей плазмиде, засейте трижды по 10-пятую клетку в шестилуночный планшет с использованием предварительно подогретого DMEM с добавлением 10% FBS. Позвольте клеткам расти при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы достичь слияния от 75 до 90%. Затем растворите 100 миллиграммов полиэтиленимина гидрохлорида или PEI max в 100 миллилитрах дистиллированной воды, чтобы получилось один микрограмм на микролитр бульона.
Отрегулируйте pH до 7,1 с помощью гидроксида натрия. Затем простерилизуйте смесь с помощью фильтра 0,22 микрометра и храните реагент в течение одного месяца при температуре четыре градуса Цельсия. В двухмиллилитровую пробирку добавьте 1,3 мкг реп/кап плазмиды, 1,3 мкг ITR, содержащей плазмиду, и 2,6 мкг аденовирусной плазмиды-хелпера к сывороточному свободному DMEM.
Общий объем этой смеси должен составлять 100 микролитров. Подготовьте отрицательный контроль в отдельной пробирке, заменив плазмиду rep/cap на неродственную плазмиду. Теперь добавьте в плазмидную смесь 5,2 микролитра PEI max.
Это позволяет поддерживать равное соотношение плазмиды к PEI. Осторожно перемешайте от 10 до 15 раз на вихревом миксере, установленном на семь. Для нескольких векторов составляйте ПЭИ с интервалом в одну минуту в течение достаточного времени на последующих шагах.
Инкубируйте каждую трубку ровно 15 минут при комнатной температуре. Затем разбавьте реакцию, добавив 1,9 миллилитра сывороточного DMEM, чтобы достичь конечного объема в два миллилитра. Осторожно дважды пипеткой, чтобы перемешать содержимое.
Отсаживайте среду из скважины. Осторожно добавьте плазмидную смесь PEI к стенкам лунки, чтобы избежать отслоения клеток, и инкубируйте клетки в течение 72 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Затем заморозьте пластину с трансфицированными клетками на 30 минут при температуре минус 80 градусов Цельсия и разморозьте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Повторите цикл в общей сложности три раза. В ламинарном проточном колпаке асептически перемешайте каждую лунку с помощью пипетирования, чтобы эффективно разрушить клетки. Переложите лизат в двухмиллилитровую пробирку.
Центрифугируйте при 15 000 G в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы удалить клеточный мусор и осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую пробирку и храните пробирку при температуре четыре градуса Цельсия. Затем поместите желаемый тип клеток в 96-луночный планшет и инкубируйте для достижения целевой конфлюенции от 50 до 75% в зависимости от продолжительности трансдукции. На следующий день проведите серию от одной до трех разбавлений сырого препарата в бессывороточных средах, чтобы получить оптимальное количество вектора, необходимое для трансдукции.
Затем отсасывайте среду из 96-луночной пластины и добавляйте в лунки от 50 до 100 микролитров разбавленного сырого препарата. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы определить эффективность трансдукции, наблюдайте за экспрессией флуоресцентного репортера с помощью флуоресцентного микроскопа через 48 часов после трансдукции.
Для дальнейшего анализа удалите вектор и промойте ячейки один раз предварительно подогретым PBS. Наконец, завершите трансдукцию путем фиксации клеток в 4% параформальдегиде на 10 минут. Данные об эффективности трансдукции показали, что AAV2 и KP1 были наиболее мощными серотипами во всех протестированных клеточных линиях.
HEPA1-6 продемонстрировал заметное снижение трансдукции по сравнению с Huh7. AAV2 эффективно трансдуцировал недифференцированные миобласты HSKMC и дифференцированные миотрубки HSKMC. Различные условия среды играют важную роль во время трансдукции.
Органоиды тонкого кишечника мышей, культивируемые в претрансдукционных средах, трансдуцировались менее эффективно по сравнению с органоидными питательными средами.
