Для начала возьмите размороженную каплю цифровой, или ddPCR master mix и добавьте к ней зонды, прямой праймер и обратный праймер при комнатной температуре. Подготовьте мастер-смесь для каждой мишени для усиления, следуя предложенному составу, показанному на экране, и при необходимости отрегулируйте концентрацию праймеров и зондов. Тщательно перебейте смесь в вихрь и кратковременно центрифугируйте ее в мини-центрифуге.
Добавьте фермент рестрикции и перемешайте. Далее в каждую лунку ПЦР-планшета добавьте по 16,5 микролитров приготовленной мастер-смеси и запечатайте пластину прозрачной клейкой пленкой. Использование буфера для разбавления пробы в качестве разбавителя, контроль качества подготовки или разведение контроля качества, как указано в этой таблице, представляет собой рекомендуемые концентрации для обеспечения точности и прецизионности проверки.
Разбавьте образцы слезы буфером для разведения образца в соотношении 1 к 10 в 0,2-миллилитровых ПЦР-пробирках и закупорьте пробирки. Нагрейте образцы в амплификаторе при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем при температуре 4 градуса Цельсия в течение не менее 5 минут. Снимите клейкую пленку с планшета ddPCR, содержащего исходную смесь, и добавьте 5,5 микролитров разведения QC в соответствующие лунки 96-луночного планшета, как показано на карте планшетов.
Затем добавьте в лунки 5,5 микролитров пробы. Добавьте 5,5 микролитров буфера для разбавления образца в контрольную ячейку без шаблона или лунки NTC. Разбавьте 2x ddPCR Buffer Control в соотношении 1 к 2, используя воду, не содержащую нуклеаз, и добавьте 22 микролитра буфера в любые пустые лунки колонки.
Добавьте на пластину прокалываемый уплотнитель из фольги и поместите пластину в запайщик для пластин. Запечатайте пластину на 5 секунд при температуре 180 градусов Цельсия. Сделайте вихревую обработку пластины на максимальной скорости в течение не менее 30 секунд и кратковременно центрифугируйте в вращательной машине для планшетов.
На сенсорном экране автоматического генератора капель выберите столбцы на карте пластин, содержащие образцы. Дека прибора загорится, указывая на то, какие расходные материалы необходимы. Загрузите генератор капель сзади вперед.
Желтый свет будет меняться с желтого на зеленый, указывая на достаточность расходных материалов. Установите холодный блок и держатель капельной пластины. Убедитесь, что блок полностью синего цвета и розовый цвет не виден.
Поместите новую пластину для сварки 96 ddPCR в холодный блок. Поместите подготовленную ПЦР-планшет в держатель планшета для образцов. Закройте крышку машины и нажмите «Пуск» для генерации капель.
В течение 30 минут извлеките пластину с каплями из холодного блока. Добавьте на пластину прокалываемый уплотнитель из фольги и поместите пластину в запайщик для пластин. Закройте его на пять секунд при температуре 180 градусов Цельсия.
Затем поместите пластину в совместимый термоамплификатор и войдите в условия циклирования, показанные на экране. Загрузите пластину в считыватель капель, убедившись, что в считывателе осталось достаточное количество масла, а в контейнере для отходов достаточно места. Наконец, нажмите кнопку чтения в программном обеспечении, чтобы начать чтение капель.
Для каждой концентрации в каждом анализе рассчитывалось среднее значение внутрипробирного анализа, которое использовалось для оценки точности и аккуратности анализа. Средняя точность между анализами составила 7,7% и средняя абсолютная точность анализа 4,2% для всех уровней контроля качества. Межпробирная точность и прецизионность также рассчитывались с использованием межпробы среднего значения каждого уровня контроля качества в каждой партии.
Была обнаружена межпромежционная точность в диапазоне от 4 до 8,5% и абсолютная точность в диапазоне от одного до 3,2%. Аналогичным образом, для образца слезы наблюдалась средняя межпрозрачная точность 3,7% при высоком уровне спайка и 12,2% при низком уровне шипа, а средняя абсолютная точность между анализами составила 11,3% на высоком уровне и 8,1% при низком уровне. В случае межпробирного расчета была обнаружена точность 5,5% на высоком уровне и 7,1% на низком уровне, а абсолютная точность 11,3% на высоком уровне и 8,1% на низком уровне.
