Для начала приготовьте разведение к образцам сыворотки крови пациента или спинномозговой жидкости для исследования. Приготовьте необходимый конъюгат в соответствующей рабочей концентрации, разбавив его в PBS 0,05%-ным Evans Blue. Для непрямых флуоресцентных тестов на антитела необходимо получить соответствующее количество подготовленных антигенных препаратов, необходимых для анализа.
Дайте слайдам разморозиться и полностью высохнуть. Затем поместите предметные стекла в заполненную ацетоном банку Coplin и переложите их в морозильную камеру с температурой минус 20 градусов по Цельсию, одобренную для легковоспламеняющихся материалов, на два часа или на ночь. После этого извлеките предметные стекла из ацетона и дайте им высохнуть на воздухе.
Теперь поместите предметные стекла в ящик камеры влажности внутри шкафа биобезопасности. Для поддержания влажности добавьте в камеру пропитанные дистиллированной водой абсорбирующие полоски. Нанесите 50 микролитров каждого контрольного образца, разведения образца или PBS в заданную лунку.
Поместите закрытую камеру влажности при температуре 37 градусов по Цельсию, 5%-ную влажность углекислого газа на 30 минут. После этого снимите камеру влажности с инкубатора и перенесите ее в шкаф биобезопасности. Используя наконечник аспиратора, осторожно отсасывайте надосадочную жидкость из каждой лунки, не нарушая монослой клетки.
После этого нанесите по одной капле PBS в каждую лунку с помощью стерильной пипетки-капельницы. Осторожно аспирируйте PBS и переложите каждый предметный стеклянный предмет в банку Coplin, наполненную PBS. Затем поместите салазки обратно в коробку с камерой влажности.
В каждую лунку нанести по 50 микролитров соответствующего конъюгата антител против человека и инкубировать в течение 30 минут во влажном инкубаторе. По окончании инкубации перенесите камеру влажности в шкаф биобезопасности. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью наконечника аспиратора.
После этого нанесите по одной капле PBS в каждую лунку с помощью стерильной пипетки-капельницы. После снятия PBS дважды промойте предметное стекло в банке Coplin PBS в общей сложности в течение 15 минут. После мытья дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе, затем установите накладку с монтажным материалом.
Возьмите предметные стекла и прочтите их под флуоресцентной микроскопией. Отсортируйте образцы от отрицательного до четырех плюсов, при этом отрицательные образцы не показывают флуоресценции, а четыре плюса показывают ярко-зеленую флуоресценцию. Назначьте образцы и конечную точку, представленные коэффициентом разбавления, при котором образец имеет от одного до двух плюсов.
После первичной вакцинации в образцах пациентов наблюдались высокие уровни иммуноглобулина М и G. Примерно через шесть месяцев после вакцинации в образцах пациентов присутствовали значительно более низкие уровни обоих антител, но уровень иммуноглобулина М снизился почти полностью. Через 18 месяцев после вакцинации антитела к иммуноглобулину М в образцах пациентов не обнаружены.
Уровни иммуноглобулина G сохранялись и оставались такими же, как и те, которые были обнаружены через шесть месяцев после первоначального снижения по сравнению с двухнедельной временной точкой.
