Подготовка образцов, экстракция РНК, очистка ПЦР и количественная оценка для полногеномного секвенирования вируса бешенства (RABV)

Приготовьте две пробирки с керамическими шариками, заполнив двухмиллилитровую ПЦР-пробирку примерно 200-литровой пробиркой, полной керамических шариков диаметром 1,4 миллиметра, и пробирку соответствующим образом промаркируйте перед тем, как поместить их внутрь стерильного колпака. Добавьте рекомендуемый объем буфера для лизиса, предоставленного в наборе для экстракции РНК, в помеченную ПЦР-пробирку. Возьмите примерно трехмиллиметровый куб из образца мозга, у которого подтверждена инфекция бешенства, с помощью деревянного аппликатора и поместите его в пробирку с маркировкой с идентификатором образца и 100 микролитров воды без нуклеаз в пробирку с надписью «отрицательный контроль».

Разрушьте мозговую ткань вручную с помощью деревянной палочки-аппликатора, а затем делайте вихрь на максимальной скорости до тех пор, пока не будет достигнута полная гомогенизация тканей. Далее центрифугируйте гомогенизированный лизат. Перенесите надосадочную жидкость в только что помеченную микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки и используйте ее для дальнейших этапов экстракции РНК, приготовления КДНК и амплификации ПЦР.

После подготовки КДНК и амплификации ПЦР с использованием пулов праймеров А и В проведите очистку ПЦР и количественное определение в области после ПЦР. Шарики Aliquot SPRI помещаются в микроцентрифужные пробирки из основной бутылки. Их также можно подготовить заранее.

Храните пробирки при температуре четыре градуса Цельсия или храните их в холодной решетке или со льдом. Затем нагрейте аликвоту шариков SPRI примерно до 20 градусов Цельсия и тщательно перебейте вихрь, чтобы повторно суспендировать шарики во всем растворе. Затем в пробирках объемом 1,5 миллилитра соедините продукты ПЦР в бассейне праймера А и пуле праймера В для каждого образца.

При необходимости добавьте воды, чтобы довести объем до 25 микролитров, прежде чем добавлять 25 микролитров гранул SPRI в каждый комбинированный продукт и перемешивать его. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 10 минут, периодически переворачивая или перелистывая трубки. Далее поместите трубки на магнитную решетку до отделения шариков и раствора.

После этого выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Затем дайте две промывки по 30 секунд, используя свежеприготовленные 200 микролитров 80% этанола и выбросьте этанол. После второго промывки удалите все следы этанола с помощью наконечника для пипетки объемом 10 микролитров.

Высушите гранулы на воздухе до тех пор, пока следы этанола не испарятся и гранулы не изменятся с блестящих на матовые. Повторно суспендируйте шарики в 15 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, чтобы восстановить очищенный продукт ДНК, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Отделите шарики от раствора на магнитной решетке.

После переноса надосадочной жидкости в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра приготовьте разведение каждого образца в воде, не содержащей нуклеаз. Измерьте концентрацию ДНК каждого разбавленного образца с помощью высокочувствительного и специфического флуориметра, следуя инструкциям производителя.