Начните заливку и загрузку проточной ячейки с проверкой качества, откинув крышку секвенционирующего устройства и сдвинув крышку заливочного порта по часовой стрелке, визуализируя отверстие заливки. Чтобы удалить пузырьки воздуха, установите дозатор P 1000 на 200 микролитров и вставьте наконечник пипетки вертикально в заливное отверстие. Поворачивайте колесико до тех пор, пока не будет видно небольшого объема, поступающего на наконечник пипетки.
Загрузите 800 микролитров предварительно подготовленной проточной смеси для грунтовки в проточную ячейку через заливное отверстие, чтобы избежать образования пузырьков. Поднимите крышку отверстия для отбора проб и загрузите 200 микролитров оставшейся грунтовочной смеси в проточную ячейку через заливное отверстие. Чтобы обеспечить смешивание загрузочных шариков, повторно суспендируйте основную смесь библиотеки с помощью пипетирования и по каплям загрузите 75 микролитров в проточную ячейку через отверстие для образца.
Аккуратно установите на место крышку отверстия для отбора проб, убедившись, что пробоотборник входит в отверстие для взятия проб. Закройте заливное отверстие и установите на место крышку устройства для секвенирования. Для вызова базы в реальном времени используйте Rampart.
Используйте среду Arctic RabV и работайте в каталоге, созданном для вывода Rampart. Затем введите команду Rampart для перехода к нужным контурам. Во-первых, протокол схемы, специфичный для Rampart, а затем base называется path, выходная папка mino fastq pass для прогона.
Откройте окно браузера и перейдите к локальному хосту 3000 в поле URL. Подождите, пока будет вызвано достаточное количество данных, прежде чем результаты появятся на экране. На трех верхних панелях отображаются сводные графики для всего прогона.
На первом графике показана глубина покрытия картированных прочтений для каждого штрих-кода на нуклеотидную позицию индексного референсного генома. На втором графике показаны сопоставленные чтения со всех штрихкодов за определенный период времени, а на третьем графике — сопоставленные чтения по каждому штрихкоду. На нижних панелях отображаются ряды графиков по штрихкоду.
Слева показана глубина покрытия картированных прочтений для каждой нуклеотидной позиции в индексном референсном геноме. Распределение длины сопоставленных операций чтения находится посередине. Доля нуклеотидных позиций в индексном референсном геноме, получающем 10-кратное, 100-кратное и 1000-кратное покрытие картированных прочтений с течением времени, показана в правом углу.
Для назначения последовательностей консенсуса по происхождению используйте MadDog. Скачайте репозиторий MadDog с GitHub, чтобы убедиться в работе с последней версией. Создайте папку в ранее созданном локальном репозитории MadDog.
Внутри папки добавьте файл fastA, содержащий согласованные последовательности. Кроме того, добавьте файл метаданных в папку. Убедитесь, что этот файл представляет собой CSV-файл с четырьмя столбцами под названием ID, country, year и assignment.
Скачайте репозиторий MadDog с GitHub, чтобы убедиться в работе с последней версией. В интерфейсе командной строки активируйте среду conda с помощью команды conda activate MADDOG. В интерфейсе командной строки перейдите в папку репозитория MadDog.
Во-первых, выполните присвоение родословной по последовательностям, чтобы проверить потенциальные аномалии и определить, целесообразно ли выполнение более длинного шага обозначения родословной, выполнив присвоение sh. sh. При появлении запроса введите Y, чтобы подтвердить, что репозиторий извлечен и работает с последней версией MadDog.
При появлении запроса введите имя папки, содержащей файл fastA в репозитории MadDog. Когда присвоение родословной будет завершено, проверьте выходной файл в папке. Если результат соответствует ожидаемому и одному и тому же происхождению назначено несколько последовательностей, то выполните обозначение происхождения.
Во время выполнения обозначения происхождения удалите только что созданный файл вывода присваивания. В терминале внутри папки репозитория MadDog выполните команду sh designation.sh. При появлении запроса введите Y, чтобы указать, что репозиторий извлечен и работа выполняется с использованием самой последней версии MadDog.
При появлении запроса введите имя папки в папке репозитория MadDog, содержащей файл fastA и метаданные. Процесс последовательности образцов для интерпретации вируса бешенства RABV был успешно использован в различных лабораторных условиях в эндемичных странах, таких как Танзания, Кения, Нигерия и Филиппины. Вызов базы в реальном времени с помощью Rampart показал генерацию прочтений в режиме реального времени и процент покрытия на выборку.
Система классификации и номенклатуры линий MadDog, используемая для компиляции и интерпретации результирующих последовательностей RABV, показала классификацию локальных линий с более высоким разрешением после присвоения MadDog.
