После выделения одиночных ядер из замороженных тканей млекопитающих осторожно проткните круглую фольгу на картридже диссоциатора с помощью наконечника пипетки. Чтобы облегчить очистку градиентом сахарозы, извлеките 900 микролитров суспензии ядер из картриджа и добавьте ее в 500 микролитров раствора сахарозы или SCS, приготовленного в двухмиллилитровой пробирке. Хорошо перемешайте с помощью пипетки до тех пор, пока смесь не станет однородной.
Далее придерживая пробирку под углом, осторожно добавьте 1 400 микролитров суспензии ядер смеси SCS по каплям на новые 500 микролитров SCS, создавая хорошо заметное разделение фаз. Осторожно закройте трубку и положите ее обратно на лед, не нарушая разделения фаз. Осторожно вращайте пробирки при 13 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в предварительно охлажденной центрифуге.
Удалите надосадочную жидкость, не нарушая палитру, и осторожно восстановите поддон в 50 микролитрах ледяного NSR. Вытащите две палитры одного и того же образца в новую трубку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 900 микролитров ледяного NSR к общему объему одного миллилитра и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.
Центрифугируйте образец при плотности 500 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия с помощью центрифуги с качающимся ведром ротора. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах PBS. Для подсчета разведите 10 микролитров суспензии ядер в 20 микролитрах PBS.
Добавьте 25 микролитров красящего раствора йодида пропидида в лунку для смешивания флуоресцентной счетной пластины. Затем добавьте 25 микролитров разведенных ядер суспензии, и хорошо перемешайте с помощью пипетирования. Перенесите 50 микролитров окрашенного образца из смесительной лунки в загрузочную лунку.
Установите счетную пластину на счетчик ячеек и начните подсчет. После подсчета разбавьте образцы PBS до нужной концентрации для секвенирования РНК по одному ядру. Используя частично автоматизированный протокол выделения ядер, ядра хорошего качества были получены без признаков дробленности, мусора или комкования.
Показаны графики Скрипки, представляющие распределение количества генов, количество UMI и содержание митохондрий в каждом образце. Были определены ожидаемые типы клеток из каждой ткани, и все животные внесли свой вклад во все кластеры, что указывает на низкую техническую вариабельность, введенную протоколом. Кроме того, пропорции клеток, количество UMI и количество генов были сопоставимы для всех трех образцов для каждого типа ткани.
