Для начала быстро разморозьте замороженный запас клеток SH-SY5Y в FBS. Дополнен 10%-ным ДМСО и разбавлен в десять раз предварительно подогретым средом. Затем центрифугируйте клетки и удалите надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах предварительно подогретой среды и семенные клетки в колбе T25. Для приготовления покровных накладок, покрытых PDL, нанесите 600 микролитров 50 микрограмм на миллилитр раствора PDL на каждую лунку стерильных камерных покровных накладок. Объем PDL, добавляемый в каждую скважину, варьируется в зависимости от размера скважины.
Выдержать крышку слипа при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации удалите раствор PDL и трижды промойте крышку стеклопакетом с 1,8 миллилитрами дистиллированной воды. Дайте камере с покрытием высохнуть на воздухе в течение двух часов.
Как только клетки SH-SY5Y достигнут 80-90% конфлюенции, диссоциируйте их, добавив раствор трипсина. Нейтрализуйте трипсин, добавив предварительно подогретую среду DMEM. Центрифугируйте суспензию ячеек и повторно суспендируйте гранулу в DMEM.
Подсчитайте ячейки на автоматическом счетчике ячеек. Далее засейте ячейки с плотностью 1,5 умножить на 10 до 10 до 4 клеток на квадратный сантиметр на камерное покровное стекло с покрытием PDL. В первый и третий день замените среду на DMEM с добавлением 5% или 2% FBS соответственно, 1% антибиотика антимикотика и либо 10 микромолярных РА, либо 95% этанола того же объема добавки, чтобы они служили в качестве средства контроля для дифференцировки.
Приготовьте бульон PKMO в предварительно подогретом фениле без красного DMEM с добавлением двух или 10% FBS в зависимости от состояния дифференцировки, 1% антибиотического антимикотика и 20 миллимолярных гепесов. На шестой день дважды промойте клетки средой для визуализации и инкубируйте клетки раствором PKMO при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут. После окрашивания трижды промойте клетки предварительно подогретым носителем для визуализации.
Для окончательной промывки инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После инкубации замените окончательную промывку свежими предварительно подогретыми средами для визуализации, содержащими 20 миллимолярных гепесов.
