Откройте программное обеспечение LightBox для получения изображения. Чтобы выбрать наборы лазеров и фильтров, используйте параметры для оранжевого красителя, выбрав краситель, используемый в окрашивании, из списка красителей. Используя обзор, нажмите на live, чтобы сфокусировать клетки.
Как только ячейки окажутся в фокусе, отрегулируйте настройки конфокального захвата. Затем нажмите прямоугольную кнопку ROI и создайте область интереса вокруг интересующей митохондрии, щелкнув и перетащив ее, чтобы сформировать область. Чтобы настроить стробирование детектора для истощения вынужденного излучения или сбора данных, рядом с общим меню выберите меню стробирования или нажмите и удерживайте, чтобы добавить меню в вид.
Для фиксации установите лазер возбуждения на 15–20%, а лазер на истощение — на 20–25% с 10 линейными накоплениями. Используйте время задержки пикселей в четыре микросекунды и размер пикселя от 20 до 25 нанометров. Чтобы выполнить интервальную съемку, выберите раскрывающееся меню времени, а затем установите количество итераций равным пяти и временному интервалу 25 или 30 секунд.
Z-стек может быть взят с помощью опции громкости и регулировки желаемого диапазона громкости Z и размера шага. Откройте программу для деконволюции изображений stead для деконволюции необработанных изображений stead с помощью программного алгоритма. Убедившись, что микроскопические параметры верны, нажмите кнопку «Экспресс» и установите тип деконволюции: «Слишком быстрый», «Стандартный», «Агрессивный» или «Консервативный» для разной степени мощности деконволюции.
Выполните деконволюцию. Сохраните изображения в формате ICS2. На изображении J нажмите на файл, затем откройте, чтобы открыть файлы ICS2 из программного обеспечения для деконволюции.
Выберите плагины, затем сегментацию с последующей обучаемой сегментацией Weka, чтобы открыть деконволюционные изображения в обучаемом плагине сегментации Weka. В настройках сегментации выберите функции «Размытие по Гауссу», «Мембранные проекции» и «Фильтр Собеля». Обозначьте один класс как cristae, а другой как фон.
Затем проведите линию над структурой, которую нужно назначить любому классу. Затем нажмите кнопку добавления справа для cristae или background. Затем нажмите кнопку классификатора поездов слева, чтобы создать карту на основе информации, предоставленной плагину.
Нажмите кнопку «Сохранить классификатор», чтобы сохранить настройки классификатора для дальнейшей сегментации. Используйте карту вероятностей cristae для порогового значения изображения на изображении J для создания двоичной маски, а затем перейдите к анализу, а затем к анализу частиц. Наконец, нарисуйте многоточечную линию, отрегулируйте толщину линии до нескольких пикселей в ширину и сделайте линию сплайном по размеру митохондрий.
В этом исследовании была проведена визуализация митохондрий в недифференцированных клетках SH-SY5Y, дифференцированных к ретиноевой кислоте, с помощью покадровой визуализации. Деконволютированные изображения можно использовать для определения периодичности кристаллов в заданной области, а также для измерения размера и формы кристаллов.
