Энуклеируйте глаза усыпленной мыши, пометив височную сторону для ориентации. Удалите переднюю камеру. Затем снимите линзу и стекловидное тело и поместите наглазники в параформальдегид на 30 минут.
Промойте наглазники PBS в течение 30 минут. Замена раствора три раза. Затем умывайтесь с 0,5% Triton X-100 в течение 30 минут.
Инкубируйте наглазники в блокирующем буфере в течение двух часов при комнатной температуре. После иммуноокрашивания изолируйте сетчатку от наглазников с помощью микроскопа. Разделите сетчатку на четыре листа и закрепите их плоско слоем ганглиозных клеток сетчатки вверх.
Убедитесь, что метка на височной стороне остается прикрепленной для ориентации. Закройте сетчатку сетчатки крепежным средством. Установите крышки на крышку.
И заклейте горки лаком для ногтей. Включите конфокальный микроскоп и в режиме «Найти» найдите интересующую область с помощью окуляра. Переключитесь в режим сбора данных и настройте плитки так, чтобы они покрывали всю сетчатку, а также срезы Z-Stack для всех слоев информации.
Нанесите не менее 25 плиток по всей сетчатке, чтобы получить общий объем. Проецируйте срезы Z-Stack для создания двумерных изображений конфокальной микроскопии на лице. Композитная фиброграмма вис-ОКТ сравнивается с соответствующим конфокальным изображением плоской сетчатки, иммуноокрашенной TuJ1 для аксонов RGC.
Кровеносные сосуды демонстрируют различимые ветвящиеся структуры, которые могут быть сопоставлены с кровеносными сосудами, меченными ICAM-2 на конфокальном изображении. Параллельное сравнение конфокальной микроскопии ex vivo и in vivo с ОКТ выявило идентичные сети пучков аксонов RGC и окружающую сосудистую сеть сетчатки.
