Для начала дважды промойте изолированные небольшие внеклеточные везикулы или СЭВ ультрацентрифугированием при 110 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 70 минут. Повторно суспендируйте везикулы в 500 микролитрах фосфатно-солевого буфера или PBS. Затем добавьте в него пять микролитров ингибитора протеазы 100X.
Подвергните образец ультразвуковому дроблению мощностью 40 Вт в течение 10 минут, с трехсекундным ультразвуковым временем и пятисекундным интервалом. Центрифугируйте измельченную смесь при 13, 700 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. К полученной надосадочной жидкости добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 50 миллимоляров.
И инкубировать его на водяной бане при температуре 56 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте в надосадочную жидкость 50 микролитров одного моляра йодоацетамида. И дайте ему вступить в реакцию при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.
Центрифугируйте смесь при 13, 700 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. И перенесите надосадочную жидкость, содержащую экстракт сырого пептида, в ультрацентрифужную пробирку мощностью 10 килодальтон. Удалите белок из сырого пептида, центрифугируя ультрафильтрационную трубку при температуре 13, 700 G и четырех градусах Цельсия в течение одного часа.
Собранные стоки высушить в вакуумном центробежном концентраторе при температуре 45 градусов Цельсия. Для обессоливания в качестве растворителя для всех реагентов используют чистую воду масс-спектрометрического качества. Во-первых, растворите сухие пептиды в 100 микролитрах 0,1% трифторуксусной кислоты или ТЖК и отложите это в сторону.
Затем добавьте по 100 микролитров чистого ацетонитрила в каждую обессоливающую колонну. Центрифугируйте колонны при 400 G в течение трех минут при комнатной температуре и выбросьте стоки. Затем добавьте 100 микролитров 50% ацетонитрила на колонну для обессоливания и повторите центрифугирование, как упоминалось ранее, прежде чем выбрасывать сточные воды.
Затем добавьте 100 микролитров 0,1% TFA в каждую колонну для обессоливания перед центрифугированием, как упоминалось ранее. Еще раз выбросьте стоки. Теперь пипетируйте обессоленные пептиды в обессоливающую колонну.
Центрифугируйте колонки, как упоминалось ранее, чтобы загрузить образец. Добавьте восстановленные стоки обратно в колонну обессоливания для повторения загрузки. Затем добавьте 100 микролитров 0,1% ТЖК.
Центрифугуйте, как упоминалось ранее, и выбросьте сточные воды. Наконец, добавьте 50 микролитров 50% ацетонитрила, содержащего 0,1% TFA, в пептид в обессоливающей колонне. После центрирования, как упоминалось ранее, соберите сток в новую центрифужную трубку масс-спектрометрического класса.
