Для начала приготовьте от 10 до 20 мкг высококачественной общей РНК для выделения поли(А)обогащенной РНК. Перенесите аликвоту РНК в безнуклеазную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Инкубируйте трубку в термоблоке при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем поместите ее на лед на две минуты.
После ресуспензии олиго(dT)шариков переложите необходимый объем суспензии шариков в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите ее на магнит на три минуты, пока магнитные шарики не сформируют гранулу. Удалите надосадочную жидкость и добавьте равный объем буфера для лизиса. Снова подвесьте бусины.
Поместите трубку обратно на магнит на три минуты и удалите надосадочную жидкость. Для первого раунда очистки добавьте буфер для лизиса в пробирку с образцом РНК и тщательно перемешайте. Затем переложите смесь в олиго(dT)шарики и полностью суспендируйте пипетированием не менее 10 раз.
Дайте образцам инкубироваться при непрерывном вращении при комнатной температуре. Через 15 минут поместите образец на магнит на пять минут или пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Выбросьте надосадочную жидкость.
Добавьте 600 микролитров промывочного буфера один к шарикам и тщательно перемешайте до повторного состояния. Далее добавьте 300 микролитров промывочного буфера на два бусины и тщательно перемешайте до повторения. Поместите трубку на магнит на пять минут или пока надосадочная жидкость не станет прозрачной.
Выбросьте надосадочную жидкость. Далее добавьте в пробирку с образцом 30 микролитров холодного 10 миллимолярного трис HCL и инкубируйте при температуре 70 градусов Цельсия. Через пять минут быстро перенесите трубку на магнит.
И когда суспензия станет прозрачной, перенесите надосадочную жидкость, содержащую элюированную поли(А)обогащенную РНК, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Для второго раунда очистки добавьте 120 микролитров буфера для лизиса к элюированному образцу РНК и тщательно перемешайте. Промойте бусины, использованные в первом раунде очистки, равным объемом буфера для лизиса.
Сделайте пипетку 10 раз, чтобы снова суспендировать шарики, а затем поместите трубку на магнит на пять минут, прежде чем выбросить надосадочную жидкость. Перенесите буферную смесь для лизиса РНК на промытые шарики и тщательно перемешайте с помощью пипетирования. После промывки шариков, как показано ранее, добавьте 25 микролитров холодного 10 миллимолярного трис HCL в пробирку с образцом и инкубируйте при температуре 70 градусов Цельсия.
Через пять минут быстро перенесите пробирку на магнит, а когда суспензия станет прозрачной, перенесите надосадочную жидкость, содержащую элюированную поли(а)обогащенную РНК, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем, для конверсии бисульфита, переведите 19 микролитров очищенного образца поли(А)обогащенной РНК в восьмиполосковую пробирку объемом 0,2 миллилитра и добавьте один микролитр контрольной РНК в заданном соотношении 1 к 10 000. После добавления в пробирки 130 микролитров конверсионного реагента и тщательного перемешивания поместите пробирку в ПЦР-машину и запустите программу ПЦР.
После ПЦР поместите колонку на пробирку для сбора и добавьте в колонку 250 микролитров буфера, связывающего РНК. Затем переложите 150 микролитров обработанного бисульфитом образца в колонку и тщательно пипетку. Добавьте в колонку 400 микролитров от 95 до 100% этанола, быстро закройте крышку и переверните несколько раз.
После повторного центрифугирования, промывки и нейтрализации с помощью буфера для десульфирования перенесите колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в столб от 20 до 30 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, и дайте ей постоять в течение одной минуты. Центрифугируйте при 10 000 G в течение 30 секунд при 25 градусах Цельсия и перенесите 2,2 микролитра надосадочной жидкости в восемь полосковых пробирок для оценки количества и качества РНК.
Эффективность обогащения поли(А)РНК оценивали с помощью анализа общей РНК капиллярного электрофореза, что приводило к снижению контаминации рибосомных РНК после двойной очистки в клеточных линиях рака поджелудочной железы. Количество РНК до и после лечения бисульфитом оценивали методом капиллярного электрофореза. После обработки бисульфитами распределение РНК по размерам показало пик от 200 до 500 нуклеотидов из-за фрагментации, вызванной реакцией бисульфита.
Капиллярный электрофорез ампликона показал успешную подготовку библиотеки с минимальным остатком праймера и отсутствием пика сверхамплификации. После того, как секвенирование прочтений было выровнено по эталонной последовательности, среднее значение 2 440 из общего числа прочтений было сопоставлено с пиковой последовательностью, а общий проанализированный коэффициент преобразования C в T достиг в среднем 99,81%
