Работая под ламинарным колпаком второго класса, начните с последовательного промывания периваскулярных жировых тканей или ПВАТ, собранных у мышей два раза. Во-первых, с помощью PBS, содержащего 10% пенициллин-стрептомицина, а, во-вторых, с помощью PBS, дополненного 1% пенициллин-стрептомицина. Переложите промытые салфетки в стерильную 60-миллиметровую чашку Петри и добавьте в нее 200 микролитров раствора для пищеварения.
С помощью стерильных ножниц измельчите салфетки на кусочки, имеющие размер в один кубический миллиметр. С помощью стерильных ножниц вырежьте пластиковый наконечник пипетки, чтобы расширить его конец. Затем переложите смесь фарша в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров с помощью наконечника пипетки с широким концом.
Добавьте шесть миллилитров раствора для пищеварения в ткани, чтобы начать пищеварение. После горизонтального завязывания пробирки на решетке инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в орбитальном шейкере в течение 30-45 минут. Каждые 5-10 минут извлекайте трубку из шейкера в инкубаторе и вручную энергично встряхивайте ее вверх и вниз.
Пропустите переваренную тканевую смесь через клеточное ситечко 70 микрон в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Промойте ситечко равным объемом питательной среды, чтобы максимизировать выход клеток и погасить пищеварение. Переложите фильтрат в новую 15-миллилитровую центрифужную пробирку.
Центрифугируйте пробирку для выделения стромально-васкулярной фракции или SVF. Переверните трубку, чтобы сбросить надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах PBS. Снова центрифугируйте пробирку при 1 800 G в течение пяти минут, прежде чем выбросить надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме питательной среды. Поместите клетки в 12-луночный планшет, покрытый коллагеном, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% углекислого газа. На следующий день удалите клеточный мусор и эритроциты, аспирировав питательную среду и промыв клетки PBS с добавлением антибиотиков, предварительно нагретым до 37 градусов Цельсия.
Наконец, добавьте по одному миллилитру свежей питательной среды в каждую лунку и продолжайте культивирование клеток до тех пор, пока они не достигнут желаемой стадии слияния.
