Для начала снимите верхнюю и нижнюю крышки со спин-колонки коммерческого набора для обогащения белка и сохраните их для использования в будущем. Поместите незакрытую спиновую колонку в пробирку для микроцентрифуги объемом два миллилитра. Центрифугируйте установку при температуре 1000 G и комнатной температуре в течение 30–60 секунд, чтобы удалить и утилизировать раствор для хранения.
Добавьте 200 микролитров промывочного буфера к гранулам обогащения в колонне отжима и перемешайте, пипетируя пипеткой вверх и вниз несколько раз. После центрифугирования спиновой колонки, как было показано ранее, выбросьте собранный буфер. Установите нижнюю крышку на место и добавьте 200 микролитров воды в колонку отжима перед заменой верхней крышки.
Приготовленную водную суспензию с гранулами смешать, пипетируя ее вверх и вниз, прежде чем перелить 40 микролитров в предварительно подготовленный образец лекарственного препарата на основе моноклональных антител. Инкубируйте пробирку, вращая ее при комнатной температуре в течение двух часов. Затем сделайте отверстия в фритте подходящего размера с помощью иглы 16 калибра и вставьте ее в конец наконечника на 200 микролитров.
Переложите образец с шариками на подготовленный наконечник и поместите его в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с отверстием в верхней крышке. Центрифугируйте наконечник в пробирке, чтобы удалить раствор. Вымойте бусины, добавив 200 микролитров буфера для стирки на кончик.
Удалите буфер для промывки, центрифугируя наконечник в пробирке микроцентрифуги объемом два миллилитра. Затем промойте шарики в наконечнике 200 микролитрами воды и центрифугой, как показано ранее, чтобы удалить воду. Теперь добавьте 10 микролитров элюирующего буфера в наконечник и тщательно пропитайте в нем шарики, пипетируя суспензию вверх и вниз 10 раз.
Перенесите наконечник в новую пробирку для микроцентрифуги объемом 0,5 миллилитра с отверстием в верхней крышке и центрифугируйте пробирку, чтобы собрать ускользающий белок. Добавьте в элюент 1,5 микролитра раствора трипсина и дайте ему перевариться в течение ночи при температуре 28 градусов. Затем добавьте в образец 1,5 микролитра 25 миллиграмм на миллилитр Дитиотрейтола и инкубируйте его при 90 градусах в течение 20 минут.
Далее инкубируют образец с 1,5 микролитрами 0,25 молярного йодоацетамида при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут. После этого добавьте 3,5 микролитра 10%-ной трихлоруксусной кислоты или ТЖК и перемешайте образец в течение двух минут. Центрифугируют образец при 14, 400 G в течение 10 минут при комнатной температуре для осаждения SDC и SLS.
Соберите подкисленную надосадочную жидкость для обессоливания. Добавьте 50 микролитров буфера B в наконечник для обессоливания GC. Затем поместите наконечник в держатель и центрифугируйте его при 1000 G в течение трех минут при комнатной температуре.
Добавьте 50 микролитров буфера А в наконечник и вращайте наконечник, как показано ранее. Теперь добавьте подкисленный образец к кончику. Центрифугируйте наконечник в держателе при 500 G в течение шести минут при комнатной температуре.
После этого вымойте кончик, добавив в него 50 микролитров буфера А и открутив его при 500 G в течение трех минут при комнатной температуре. Элюируют пептид из наконечника для обессоливания GC, добавив 50 микролитров буфера B и центрифугируя наконечник в новой пробирке при 500 G в течение трех минут при комнатной температуре. После этого высушите собранный элюент с помощью вакуумного концентратора.
Повторно суспендируйте высушенный элюент в 30 микролитрах 0,1%-ного раствора муравьиной кислоты. Измерьте ультрафиолетовое поглощение пептидных смесей на длине волны 214 нанометров с помощью спектрофотометра. Наконец, перелейте 10 микролитров переваренного образца в пробирку для жидкостной хроматографии и проанализируйте один микрограмм образца с помощью nano ЖХ-МС/МС.
Профили общей ионной хроматограммы белков клетки-хозяина показали, что по сравнению с прямым расщеплением, большинство основных пептидов моноклональных антител были либо снижены, либо удалены после продемонстрированного обогащения белка в сочетании с ограниченным протоколом пищеварения.
