Посев mDA-нейронов человека, полученных из iPSC, и лечение компаундами для фенотипического профилирования

Для начала достаньте из холодильника 384-луночный планшет с предварительно покрытым поли-D-лизином, содержащий 25 микролитров ламинина на лунку, и уравновесьте планшет до комнатной температуры в течение примерно 30 минут под колпаком для клеточных культур. Непосредственно перед посевом отсасывайте по 15 микролитров лакирующего раствора из каждой лунки с помощью автоматизированного манипулятора жидкости или 16-канальной пипетки. Затем выдайте в каждую лунку по 50 микролитров клеточного раствора, содержащего 300 000 нейронов на миллилитр.

Избегайте заполнения ячеек в столбцах 1, 2, 23 и 24, а также в строках A, B, O и P, чтобы свести к минимуму возможные эффекты краев. Заполните эти неиспользованные лунки 80 микролитрами фосфатно-солевого буфера. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислым газом.

Разогрейте соответствующий объем полной технической среды при комнатной температуре и вдали от света. Приготовьте концентрированный в 1,5 раза раствор соединения для всех желаемых концентраций, подлежащих испытанию, используя полную поддерживающую среду для разведения. С помощью автоматической системы пипетирования отбраковывайте 40 микролитров среды на лунку из нейронсодержащей пластины, оставляя 20 микролитров среды на лунку.

Затем добавьте 40 микролитров концентрированного в 1,5 раза раствора компаунда на лунку для достижения нужной конечной концентрации. В соответствии с желаемым протоколом здоровые донорские или несущие мутацию дофаминергические нейроны среднего мозга LRRK2 G2019S были успешно культивированы в течение шести дней и обработаны либо диметилсульфоксидом, либо ингибитором киназы LRRK2. Нейроны окрашивали ядерным красителем и антителами против альфа-синуклеина, тирозингидроксилазы и MAP2.