Размораживание нейронов mDA человека, полученных из iPSC, для посева

Чтобы оттаяли нейроны в день посева, предварительно прогрейте водяную баню до 37 градусов тепла. Кроме того, уравновесьте всю рабочую среду до комнатной температуры, защищая ее от света. Тем временем извлеките флакон с коммерчески полученными замороженными нейронами из резервуара с жидким азотом и перенесите его в сухой лед.

Затем поместите флакон на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на две минуты, чтобы обеспечить полное оттаивание. После этого продезинфицируйте флакон с помощью 70% этанола. С помощью пипетки P1000 перенесите примерно 370 микролитров размороженных нейронов из флакона в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.

Промойте пустой флакон 630 микролитрами полной поддерживающей среды. И с помощью пипетки дозируйте среду по каплям в 50-миллилитровую трубку под углом 45 градусов. Аналогичным образом, используя пипетку P1000, добавьте один миллилитр полной рабочей среды в 50-миллилитровую центрифужную пробирку.

Затем медленно добавьте в пробирку еще два миллилитра полной поддерживающей среды. Далее смешайте в микропробирке 10 микролитров трипанового синего с 10 микролитрами клеточной суспензии. Затем добавьте 10 микролитров смеси в предметное стекло счетной камеры для подсчета ячеек.

После подсчета клеток и переноса нейронов в 15-миллилитровую пробирку центрифугируйте при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Впоследствии удалите надосадочную жидкость. С помощью пипетки P1000 осторожно ресуспендируйте гранулу нейрона в одном миллилитре полной поддерживающей среды.

Наконец, добавьте необходимый объем среды для достижения желаемой концентрации для засеивания нейронов в тот же день.