Для начала откройте многоканальное изображение стека Z на Фиджи и откройте файл скрипта анализа биосенсора. Нажмите кнопку Run в окне редактора скриптов, чтобы запустить скрипт. Затем введите запрашиваемую информацию в появившемся диалоговом окне.
Выберите номера каналов числителя и знаменателя для расчета соотношения. Для митохондрий, нацеленных на HyPer7, числителем является канал, возбужденный на 488 нанометрах, а знаменателем — канал, возбужденный на 405 нанометрах. Выберите номер канала передаваемого светового изображения, если он есть, или ноль, если его нет.
Затем выберите нужный метод вычитания фона. Если фон однородный, нажмите кнопку «Выбрать область изображения», чтобы измерить уровень фона на изображении. После этого выберите желаемый метод вычитания шума, чтобы уменьшить случайные изменения в показаниях детектора.
Нажмите кнопку Выбрать область изображения. Выберите параметр фиксированного значения, чтобы ввести ранее измеренный уровень шума, который обычно хорошо работает, если условия изображения остаются постоянными. Для точного и последовательного обнаружения митохондрий выберите алгоритм порогового значения, такой как Otsu или максимальная энтропия.
Используйте один и тот же алгоритм для всех изображений в эксперименте, но убедитесь, что митохондрии точно распознаются. Затем выберите количество интересующих областей в каждой ячейке. Например, если вы измеряете разницу между материнскими почками, выберите две.
Выберите выходную папку, в которую будут сохраняться измерения и соотношения изображений. Для коррекции фона или шума выберите «Выбрать область изображения». Следуйте инструкциям, чтобы нарисовать область фона с помощью инструмента «Прямоугольник ROI», и нажмите «ОК».
Анализируя отдельные клетки или субклеточные области, рисуйте интересующие вас области на основе светлого изображения. ROI не обязательно должен точно соответствовать контуру клетки, так как будет измеряться только пороговое количество митохондрий в пределах ROI. После создания каждого ROI нажмите T, чтобы добавить выбранный ROI в Менеджер ROI.
Установите флажок «Показать все» в менеджере ROI, чтобы задокументировать отмеченные ячейки. Каждый добавленный регион будет отображаться в виде пронумерованного элемента в списке менеджера ROI. При анализе более одного ROI на ячейку отметьте ROI в том же порядке для каждой анализируемой ячейки.
После того, как все желаемые ROI были добавлены в менеджер ROI, нажмите «ОК» в диалоговом окне «Отметить ячейки». Далее выберите формат таблицы измерений. В диалоговом окне «Мультимер» отметьте параметры «Измерить все срезы» и «Одна строка на срез», чтобы создать таблицу нужного формата.
Используйте процесс мульти таблиц ROI. rscript для обработки таблиц, созданных с помощью опции one-row-per-slice. Не отмечайте опцию append-results.
Сохраните выходные файлы в выбранную папку с помощью скрипта. Теперь откройте изображение стека с коэффициентом Z на Фиджи, чтобы создать цветное изображение с пропорциями. Затем откройте colorize_ratio_image.
ijm script file и нажмите Run в окне редактора скриптов. Появится диалоговое окно с предложением ввести запрашиваемую информацию. В немодулированном варианте все митохондриальные пиксели отображаются с одинаковой яркостью.
Некоторые изображения могут казаться зашумленными, так как тусклые и яркие пиксели влияют на соотношение изображения. Используйте опцию модуляции интенсивности, чтобы уменьшить шум. В методе отображаемых минимальных и максимальных значений выбирайте значения, близкие к средним минимальным и максимальным значениям, наблюдаемым в эксперименте.
Чтобы обеспечить согласованность, получайте все изображения с использованием одних и тех же условий изображения и отображайте все изображения с одинаковыми минимальными и максимальными значениями. Затем выберите режим проекции, чтобы спроецировать стек Z и показать всю популяцию митохондрий до раскрашивания. Для проекции максимальной интенсивности выберите максимальную.
Чтобы создать проекцию средней интенсивности, выберите среднюю. Наконец, выберите папку для сохранения раскрашенных изображений. Если выбран вариант без модулирования, выберите цветовую схему в появившемся диалоговом окне.
Используйте таблицы поиска fire или rainbow RGB, встроенные в Fiji, или любую другую таблицу поиска в формате LUT от ImageJ. С помощью скрипта сохраните выходные файлы в выбранную папку. Окисленное восстановленное соотношение митохондрий, меченных HyPer7, показало дозозависимую реакцию на концентрацию перекиси водорода, которая достигала плато при одном-двух миллимолярах при добавленной извне перекиси водорода.
Различия в митохондриальной перекиси водорода наблюдались в дрожжевых клетках. В митохондриях в зародыше обнаружено статистически значимое снижение показаний биосенсора перекиси водорода по сравнению с материнской клеткой.
