В нулевой день 10 миллионов 293T клеток в 30 миллилитрах DMEM, не содержащих антибиотиков, содержащих 10% FBS в 15-сантиметровой чашке. Приготовьте в общей сложности 10 таких блюд. На следующий день, который является первым днем, подтвердите, что клетки на 80% слиты и готовы к трансфекции.
Затем в коническую пробирку объемом 50 миллилитров последовательно добавьте 600 микролитров по 0,5 микрограмма на микролитр упаковочной плазмидной смеси и 60 микролитров библиотеки плазмидных штрихкодов. В отдельной конической трубке объемом 15 миллилитров смешайте 900 микролитров реагента для трансфекции и 12 миллилитров DMEM методом вортексирования. Добавьте 12,9 миллилитров этой смеси в смесь ДНК и просто перемешайте.
Не перемешивая дальше, инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем по капле добавьте 2,5 миллилитра инкубированной смеси в каждую 15-сантиметровую чашку, содержащую клетки 293T, и инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для культур тканей. На третий день соберите вирус, пропустив фильтрующую среду через установку фильтрации 0,2 микрона.
Аликвотируйте фильтрат, содержащий вирусные частицы, в конические пробирки объемом 15 миллилитров. Кроме того, приготовьте пять одномиллилитровых аликвот отфильтрованного вируса в криопробирках для титрования вируса. Чтобы титровать лентивирусные пулы, добавьте 65 микролитров катионного полимера в стерильную стеклянную колбу, содержащую 65 миллилитров среды для роста опухолевых клеток.
Пипеткой вносите один миллилитр среды, содержащей полимер, на лунку в 11 шестилуночных планшетов для культивирования тканей. Далее трипсинизируют рано пассаж опухолевых клеток. После подсчета клеток предпочтительным методом перенесите клетки в шестилуночные планшеты.
Разморозьте один миллилитр аликвоты 48-часового лентивируса из морозильной камеры на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Следуйте таблице, чтобы подготовить инфекцию для каждого вирусного модуля.
