Чтобы настроить новую многоканальную систему культивирования без насоса, после сборки модуля резервуара для фильтрующего материала или MRM вставьте в него трубки в сборе и поместите MRM в нагреватель. Закрепив нагреватель на месте, приступайте к вставке узлов тканевой камеры или ТЦА в модуль перфузионной камеры или БКМ. С помощью инструмента для вставки TCA вставьте каждый из восьми TCA по одному в отверстия PCM.
Убедитесь, что инструмент плотно надавливает на адаптер до тех пор, пока верхняя часть втулки трубки вокруг каждой камеры не коснется поверхности, очерчивающей отверстия в PCM. Отложите частично собранный ПКМ вместе с ортезой БКМ и шестью винтами. Через 30 минут после сборки корпуса и после того, как MRM достигнет желаемой температуры, с помощью пипетки объемом 50 миллилитров перенесите предварительно уравновешенный перфузат в предварительно нагретую вставку MRM, осторожно диспергируя жидкость по стенкам.
Затем, чтобы поместить БКМ на МРМ, вставьте трубки сопротивления ТСА, выходящие из нижней части БКМ, во вставки МРМ, по четыре с каждой стороны делителя МРМ. Сориентируйте модуль так, чтобы тканевые камеры упирались в кислородный детектор после его установки. Закрепите БКМ на опорной скобе с помощью шести винтов и электрической отвертки.
Затем закрепите ТСА в пределах опорных ребер ПКМ с помощью прилагаемой резинки, натянув ее вокруг ребер на уровне резиновых прокладок. Расположите кислородный детектор на стойке детектора так, чтобы его лицевая сторона упиралась в ребра PCM. Совместите пары светодиодного фотоприемника с кислородочувствительным красителем в тканевых камерах, ослабив винты, установленные на боковой стороне держателя детектора, и при необходимости отрегулировав боковые направляющие детектора.
Наконец, накройте корпус крышкой. Чтобы загрузить ткань в камеры, подождите, пока уровень среды не окажется на расстоянии 0,5 дюйма от верха. Для нагружения собранной сетчатки или склеры сосудистой оболочки РПЭ с помощью тонких точечных щипцов аккуратно поместите сетчатку, не складывая ее в каждую камеру.
Тем временем используйте салфетку, чтобы жидкость из тканевой камеры не капала на датчик кислорода. Дайте ткани опуститься по направлению к FRET и на него. Для загрузки элементов РПЭ на мембраны Transwell после пропускания подготовленных клеток 0,25% трипсина ЭДТА затравливают на полиэтилентерефталатные фильтры с тротравлением порами 0,4 мм.
В день эксперимента разрежьте мембраны на три полоски равной ширины и загрузите их в тканевые камеры с помощью щипцов. Скорость потребления кислорода сетчаткой была постоянной в течение всего времени введения исследуемых соединений, что указывает на стабильное здоровье и функцию ткани и подтверждает валидность метода. В соответствии с данными, полученными с использованием традиционных методов перфузии для склеры сетчатки и сосудистой оболочки РПЭ, OCR снижался в ответ на олигомицин и увеличивался в ответ на FCCP.
Наблюдаемые изменения в скорости выработки лактата или LPR были противоположны тем, которые наблюдались при OCR. Клетки РПЭ, которые ранее не анализировались с помощью проточных систем, аналогичным образом реагировали на склеру сосудистой оболочки РПЭ с использованием этого метода.
