Суспензионно-улавливающая пробоподготовка слезного белка человека

Начните с нормализации образцов слезного белка человека до 50 микрограммов белка. Затем добавьте 200 миллимолярного дитиотреита, или DTT, к окончательной концентрации 20 миллимолярных DTT, инкубируйте при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут. Охладив белковый раствор до комнатной температуры, добавьте 400 миллимоляров йодоацетамида до конечной концентрации 40 миллимоляров, затем инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем добавьте 12% водную фосфорную кислоту в соотношении один к 10, в результате чего конечная концентрация составит 1,2%. Быстро перемешайте смесь в вихре, чтобы перемешать раствор. Добавьте буфер, связывающий белок, в соотношении один к шести, прежде чем снова вортексить.

Откройте крышку микроспиновой колонны для улавливания суспензии и установите спиновую колонну на двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку для сбора потока. Добавьте в колонку до 200 микролитров смеси подкисленных белковых лизатов. Центрифугируйте колонку при 4000 G в течение 20 секунд.

Далее добавьте 150 микролитров буфера, связывающего белок, и центрифугуйте, как и раньше, чтобы промыть взвешенный белок. Соберите микроколонку для улавливания суспензии на новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Осторожно добавьте 20 микролитров буфера для сбраживания TEAB в фильтр внутри спиновой колонны, избегая образования пузырьков и воздушных зазоров.

Надежно закройте крышку микроспиновой колонки для предотвращения испарения. Выдерживать при температуре 47 градусов Цельсия в течение одного часа в термомиксере без встряхивания. Элюируйте пептиды с 40 микролитрами 50 миллимолярного TEAB.

Затем центрифугируйте его при 4000 G в течение 20 секунд. Теперь добавьте 40 микролитров 0,2% муравьиной кислоты и центрифугируйте, как и раньше. Наконец, добавьте 35 микролитров 0,2% муравьиной кислоты и 50% в ацетонитрил перед повторным центрифугированием.

Вытяните три элюента и высушите их с помощью вакуумной центрифуги. После высыхания храните образцы при температуре 80 градусов Цельсия для будущего анализа. Поиск в зависимости от данных дал в общей сложности 1183 плюс-минус 118 белков в группе захвата суспензии и 874 плюс-минус 70 белков с 1% FDR в группе в растворе.

Онтологический анализ генов выявил сходные протеомы для обоих подходов, основной функцией которых является связывающая каталитическая активность и регуляция молекулярной функции.