Получение органоидов почек из индуцированной культуры суспензии плюрипотентных стволовых клеток

Начните с удаления среды II стадии из суспензии клеток iPSC на седьмой день культивирования. Теперь промойте клетки двумя миллилитрами DPBS. Пипеткой нанесите по одному миллилитру раствора для отслоения клеток в каждую лунку.

Затем поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов на пять минут. После инкубации добавьте в клетки один миллилитр среды II стадии и тщательно перемешайте до тех пор, пока клетки не оторвутся от поверхности. Соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку, затем центрифугируйте ее при 400г в течение трех минут при комнатной температуре.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах среды III стадии. Аккуратно перемешайте раствор. Теперь засейте суспензию в шестилуночную пластину с низким уровнем адгезии в соотношении один к трем.

Поместите тарелку на орбитальный шейкер в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы удалить среду в суспензионной культуре, сначала отрежьте кончик одномиллилитровой пипетки с помощью асептических ножниц. Затем аккуратно перемешайте шестилуночную пластину, чтобы централизовать органоиды.

Затем аспирируйте органоиды с помощью подготовленных пипеток и поместите их в пробирку объемом 15 миллилитров, дав им постоять пять минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы органоиды оставались у основания трубки. Затем введите в пластину среду пипетки III ступени.

Пипеткой в смесь нужно ресуспендировать органоиды. Переложите органоиды обратно в шестилуночную пластину с низкой адгезией. Продолжайте встряхивать пластину с низким уровнем адгезии со скоростью 60 оборотов в минуту в инкубаторе.

На 12-й день замените среду на среду IV стадии. Почечные органоиды имеют трубчатую структуру и легко наблюдаются на изображениях в ярком поле после 18 дней агрегации. Индуцировали эндотелиальные клетки CD31.

Декстран вводили в проксимальные канальцы органоидов почек.