Начните с извлечения геномной ДНК из листьев бамбука дикого типа и зараженных агробактериями. Амплифицируйте геномную ДНК, содержащую целевой сайт целевых генов из листьев бамбука дикого типа и инфицированных агробактериями, используя следующие условия ПЦР. После ПЦР проведите расщепление эндонуклеазного фермента, приготовив реакционную смесь, содержащую один микролитр age-1, один микрограмм продуктов ПЦР и пять микролитров 10X буфера.
Затем добавьте воду до конечного объема 50 микролитров. Инкубируйте смесь для смешения при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. С помощью гель-электрофореза анализируют долю переваренных фрагментов ДНК.
Сравните переваренные фрагменты из образцов дикого типа и образцов, инфицированных агробактериями, чтобы оценить эффективность редактирования генов. Подвергайте саженцы бамбука воздействию условий высокой интенсивности света, чтобы увеличить количество поглощенного света и активировать систему фотозащиты листьев. Затем включите флуориметр IMAGING-PAM и установите интенсивность актинического света для измерения in vivo флуоресценции хлорофилла II листьев бамбука в фотосистеме II.
Красный цвет бета-полосы, полученный геном RUBY, указывает на успешную экспрессию генов агробактерий в листьях бамбука. Из четырех штаммов Agrobacterium штамм GV3101 вызвал наиболее значительное накопление бета-полос в инфицированных листьях бамбука. После заражения конструкциями CRISPR-Cas9 и обработки высоким светом определенные участки листовых пластинок показали более низкие значения нефотохимического гашения.
Кроме того, анализ ферментного расщепления и секвенирования подтвердил успешную мутацию гена PeVDE в отредактированных областях. Результаты секвенирования по Сэнгеру фрагмента PeVDE после редактирования как sgRNA1, так и sgRNA2 показали делецию длинного фрагмента в гене PeVDE. Через 30 дней после заражения агробактериями участки листьев, трансфицированные sgRNA как для PeVDE, так и для PeCCR5, показали более низкие значения нефотохимического гашения.
