Для начала, после получения длинной некодирующей РНК, представляющей интерес, инкубируйте буфер для гибридизации при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем растворите четыре зонда оптической плотности в 160 микролитрах обработанной диэтилпирокарбонатом деионизированной воды вдали от света. Приготовьте по 200 микролитров смеси зонда для каждой лунки, и установите серию по 50, 25, 12,5 и шесть микрограмм на миллилитр.
Денатурируйте зонд при температуре 73 градуса Цельсия в течение пяти минут. Возьмите 12-луночный планшет для культивирования клеток, содержащий 143B клетки, на стерильных стеклянных покровных листах. Удалите среду и промойте дважды в течение пяти минут PBS.
Поместите ячейки на шейкер. Затем снимите ПБС и добавьте в каждую лунку по 200 микролитров 100% этанола, зафиксировав в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем удалите этанол, добавьте в каждую лунку по 200 микролитров 0,1% Triton X-100 и выдерживайте 15 минут при комнатной температуре.
Удалите 0,1% Triton X-100 и промойте два раза в течение пяти минут PBS. Далее удалите PBS, добавьте в каждую лунку по 200 микролитров двукратного цитрата натрия или буфера SSC и выдерживайте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Дважды удалите буфер SSC, добавьте по 200 микролитров 70%-ного этанола в каждую лунку и выдерживайте в течение трех минут при комнатной температуре.
Выбросьте 70% этанола, затем добавьте 200 микролитров 85% этанола в каждую лунку и выдерживайте в течение трех минут при комнатной температуре. Далее выбросьте 85%-ный этанол, добавьте в каждую лунку по 200 микролитров 100%-ного этанола и выдержите в течение трех минут при комнатной температуре. После этого впитайте и выбросьте 100% этанол и дайте лункам высохнуть.
Затем добавьте по 200 микролитров денатурированной смеси зонда в каждую лунку, затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день удалите образцы с температурой 37 градусов Цельсия, выбросьте смесь зондов и добавьте в каждую лунку 200 микролитров предварительно нагретого 0,4 раза SSC 0,3%Tween 20 буфера и промойте в течение двух минут при комнатной температуре. Удалите буфер в 0,4 раза больше SSC 0,3%Tween 20.
Добавьте 200 микролитров в два раза SSC 0,1%Tween 20 буфера в каждую лунку и промывьте в течение двух минут при комнатной температуре. Затем отбросьте буфер, дважды умноженный на SSC 0,1%Tween 20. Добавьте 200 микролитров раствора для окрашивания DAPI и окрашивайте в течение 20 минут в темноте на шейкере.
После окрашивания выбросьте раствор DAPI и постирайте его с PBS в течение двух минут при комнатной температуре. Наконец, добавьте 50 микролитров монтажной среды, содержащей камедь, на предметное стекло и установите стеклозащитное стекло для фиксации предметного стекла. Показаны репрезентативные изображения SNHG6 FISH в клетках остеосаркомы человека.
Зонд SNHG6, меченный Cy3, который излучает красную флуоресценцию, показал, что SNHG6 в основном локализован в цитоплазме. При использовании зонда высокой концентрации наблюдался цвет фона.
