Иссечение сетчатки крысы и монтаж на пористую мембрану для визуализации кальция

За две-три недели до визуализации в стекловидное тело глаза крысы, находящейся под наркозом, вводятся вирусные частицы, несущие генетически закодированный индикатор кальция. С помощью фундоскопии и ОКТ структура сетчатки исследуется на предмет побочных реакций от введения индикатора кальция. Через две недели после инъекции слой ганглиозных клеток или GCL продемонстрировал флуоресцентное излучение.

Затем инициируется иссечение сетчатки у усыпленной крысы. Возьмите глаза, экспрессирующие AAV2-CAG-GCaMP5G, и удалите всю ткань вокруг глазного яблока с помощью небольших изогнутых щипцов и ножниц с тонкими пружинами. Далее возьмите лист фильтровальной бумаги три на три сантиметра.

Поместите его на крышку 3,5-сантиметровой посуды и промокните фильтровальную бумагу средством AIMS. Расположите глазное яблоко на бумаге так, чтобы передний сегмент был направлен к оператору. Используйте пару прямых щипцов, чтобы удерживать глазное яблоко под углом примерно 45 градусов от поверхности посуды.

Используйте зазор между прямыми щипцами для направления разреза лезвием. Затем погрузите глазное яблоко в среду AIMS. Используйте прямые щипцы и ножницы с тонкими пружинами, чтобы разделить передний и задний сегменты глаза.

Осторожно снимите хрусталик с помощью двух пар прямых щипцов и отсоедините сетчатку от склеры. С помощью тонких пружинных ножниц сделайте разрез в склере по направлению к зрительному нерву и разрежьте до тех пор, пока сетчатка не будет успешно отделена от наглазника. Перенесите вырезанный кусочек сетчатки на монтажную мембрану с помощью пластиковой пипетки с отрезанным наконечником.

Затем с помощью пары прямых щипцов установите сетчатку на плоской поверхности, убедившись, что слой ганглиозных клеток ориентирован вверх. Затем используйте пластиковую пипетку с наконечником для пипетки объемом 100 микролитров, чтобы удалить медиа, облегчая прилипание части сетчатки к пористой мембране. Затем переверните сборку на микроэлектродную матрицу или MEA, расположив GCL поверх электродов.

Затем заполните ванну с образцом насыщенной кислородом средой AIMS.