Визуализация кальция ex vivo плоской сетчатки крысы при электрической стимуляции

Поместите GCaMP 5G экспрессирующую сетчатку крысы на MEA так, чтобы GCL была обращена к электродам на предметном столике микроскопа. Подключите систему перфузии и установите параметры для постоянной перфузии ванны с образцом с насыщенной кислородом средой AMS. Затем осмотрите сетчатку с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного люминесцентной лампой, фильтром FITC и CMOS-камерой.

Ищите область, где видны стимулирующие электроды и флуоресценция от клеток, экспрессирующих GCaMP. В программном обеспечении генераторов импульсов настройте параметры электростимуляции, такие как форма, амплитуда, продолжительность, фазовая задержка и частота импульсов для приложения. Подключите камеру к генератору импульсов с помощью выходного сигнала запуска и установите режим захвата программного обеспечения камеры на внешний пусковой триггер.

Нажмите кнопку запуска в программном обеспечении камеры, чтобы она ожидала запуска внешнего триггера. Запустите процесс получения изображений с помощью программного обеспечения генератора импульсов и сохраните полученные изображения, убедившись, что имя файла включает все примененные параметры электростимуляции. Теперь откройте изображение J и сегментируйте интересующую область с помощью инструментов выделения области, добавьте ее в менеджер ROI и сохраните как zip-папку с помощью меню менеджера ROI.

Извлеките среднее значение серого из сомы ячейки, перейдя к разделу «Больше» и щелкнув «Мультимер». Включите параметр Измерять все 600 срезов и одну строку на срез, чтобы получить одну таблицу, в которой столбцы соответствуют ROI, а строки — временным рамкам. Затем извлеките центроид из ROI с помощью команды measure.

Чтобы скорректировать эффект обесцвечивания фотографий и свести к минимуму фон, выберите примерно от 15 до 20 кадров из нестимулирующих интервалов перед каждой серией и подогните эти кадры к линейной кривой для обеспечения оптимального анализа данных. Показаны следы кальция в клеточных сомах при пяти всплесках пульсовых последовательностей каждые 10 секунд в течение 60-секундного получения изображения. Рамки из нестимулирующих периодов используются для коррекции эффекта фотообесцвечивания.

Соотношение между током, необходимым для активации клеток, и расстоянием от стимулирующего электрода показало, что ячейки, расположенные ближе к стимулирующему электроду, требуют более низких значений тока, чтобы вызвать ответную реакцию.