Начните с погружения расщепленной сетчатки мыши с прикрепленными нитроцеллюлозными мембранами в 4%-ный параформальдегид на лед на 30 минут. Затем замените параформальдегид 5-10 миллилитрами PBS комнатной температуры, чтобы промыть расщепленную сетчатку. Перед тем, как извлечь расщепленную сетчатку из нитроцеллюлозы, используйте гидрофобную барьерную ручку для подготовки круглых лунок на предметном стекле микроскопа.
Дайте лункам высохнуть на воздухе в течение 5-10 минут. После этого поместите расщепленные сетчатки в подготовленные лунки и добавьте достаточное количество PBS, чтобы погрузить их. Под диссекционным микроскопом аккуратно приподнимите края ткани тонкой кистью и обведите сетчатку, чтобы отделить ее от мембраны.
Используйте щипцы и кисть, чтобы удалить мембрану из-под плавающей части сетчатки. Затем осторожно отсасывайте остатки PBS так, чтобы ткань сетчатки лежала на предметном стекле микроскопа ганглиозной клеточной стороной вниз. Иммунофлуоресцентное мечение синаптофизина в верхней части расщепленной сетчатки указывало на то, что синаптические окончания фоторецепторов были сохранены.
Однако ядра фоторецепторов отсутствовали, что подтверждает расщепление сетчатки через аксоны фоторецепторов. Синаптическую целостность оценивали путем мечения RGS11 в дендритах ON-BC и CtBP2 в фоторецепторных синаптических лентах. Расщепление не повредило морфологию клемм фоторецепторов в наружном плексиформном слое.
Жизнеспособность эритроцитов в расщепленной сетчатке оценивали с помощью ядерного красителя ближнего инфракрасного диапазона. Наблюдалась региональная вариабельность жизнеспособности клеток по всей ткани с более высокой гибелью клеток в некоторых областях, при этом большинство эритроцитов оставались жизнеспособными после расщепления. Иммунофлуоресцентное мечение эритроцитов против PKC альфа и горизонтальных клеток против Calbindin-D показало быструю диффузию антител в расщепленной сетчатке после часовой инкубации.
