Для начала возьмите 500 микролитров приготовленного раствора PBS/BEV. Соедините его с тремя миллилитрами PBS и аккуратно перемешайте с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров. Поместите ультрацентрифужную пробирку объемом 31 миллилитров на поролоновую пластину с отверстиями, и пробирку промаркируйте стрелкой вниз.
Затем держите пипетку объемом 1000 микролитров вертикально и добавьте три миллилитра 50% раствора йодиксанола на дно пробирки. Поместите держатель трубки немного выше уровня поролоновой пластины ниже отверстия трубки и наклоните трубку под углом 70 градусов. С помощью пипетки объемом 1 000 микролитров добавьте три миллилитра 40% раствора йодиксанола поверх 50% раствора йодиксанола.
Затем нанесите три миллилитра 20% раствора йодиксанола на 40% раствор йодиксанола. С помощью пипетки объемом 1 000 микролитров добавьте три миллилитра 10%-ного раствора йодиксанола поверх приготовленного 20%-ного раствора йодиксанола. Затем добавьте 3,5 миллилитра раствора PBS/BEV поверх 10% раствора йодиксанола и аккуратно верните пробирки в вертикальное положение.
Теперь поместите 31-миллилитровую ультрацентрифужную пробирку на поролоновую пластину с отверстиями и пометьте ее стрелкой вверх. Используя пипетку объемом 1000 микролитров, вертикально добавьте 2,5 миллилитра 60% йодиксанолового раствора на дно пробирки и соедините его с 500 микролитрами раствора PBS/BEV, чтобы получить три миллилитра 50% йодиксанола BEV. Тщательно перемешайте раствор с помощью пипетирования.
Затем, последовательно расслоив 40, 20 и 10% раствор йодиксанола, используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы добавить 3,5 миллилитра PBS поверх 10% раствора йодиксанола. Отрегулируйте вес двух пробирок с PBS до общего веса в пределах плюс минус 0,005 грамма. Затем поместите пробирки в ведра и центрифугируйте их при температуре 160 000 G в течение семи часов при четырех градусах Цельсия.
С помощью пипеттера соберите фракции, полученные в режиме градиентного ультрацентрифугирования, последовательно сверху вниз у боковой стенки в 10 отдельных ультрацентрифужных пробирок объемом 38,5 миллилитров. Затем ультрацентрифугируйте фракции при 160 000 G в течение 70 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и переверните пробирки ультрацентрифуги на пять минут.
Далее повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах предварительно охлажденного PBS с помощью пипетки объемом 200 микролитров. Перелейте раствор PBS/BEV в чистую микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Пометьте фракции от F1 до F10, полученные в одном режиме градиентного ультрацентрифугирования, и приступайте к анализу.
