Для начала опрыскайте усыпленную мышь 75%-ным спиртом. Затем вы стерилизовали препарирующие ножницы, чтобы вскрыть кожу и обнажить грудную полость. Разрежьте диафрагму, затем продолжайте разрез вверх по направлению к нижней челюсти и осторожно удалите излишки соединительной ткани и жира, обнажив сонную артерию.
Затем перерезают нижнюю полую вену, чтобы кровь вытекала из замкнутого кровообращения. С помощью шприца медленно вводят 20 миллилитров предварительно охлажденного перфузионного раствора в левый желудочек. Поместите мышь под стереоскопический микроскоп.
Затем с помощью микроножниц отшелушивают жировую и соединительную ткани вокруг сонной артерии. Изолируйте сонную артерию и промойте ее PBS, чтобы смыть остатки крови. Перенесите артерию на шестилуночную пластину, содержащую 1,5% FBS на льду.
Используя ножницы для микропрепарирования, рассеките сонную артерию в продольном направлении и поместите ее в новую шестилуночную пластину, содержащую один миллилитр FBS на льду. Осторожно промойте интиму артерии ФБС, чтобы удалить остатки крови. Разрежьте артерию на двухмиллиметровые квадратные кусочки ткани и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Центрифугируйте при 400 G в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы опустить ткани на дно. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ткани в 500 микролитрах диссоциационного реагента A. Поместите пробирку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на один час, осторожно пипетируя пипеткой объемом один миллилитр каждые 10 минут. Затем добавьте в пробирку 500 микролитров 5%-ного FBS и хорошо перемешайте.
Отфильтруйте клеточную суспензию через стерильное ситечко размером 40 микрон в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Затем центрифугируют фильтрат и удаляют надосадочную жидкость перед повторным суспендированием гранулы в 200 микролитрах диссоциационного реагента B. Поместите пробирку на водяную баню, чтобы полностью диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию. Через пять минут добавьте 200 микролитров 5%-ного ФБС, чтобы прекратить реакцию сбраживания, центрифугируйте суспензию и выбросьте надосадочную жидкость перед повторным суспендированием гранулы в 100 микролитрах PBS на льду.
Микроскопические наблюдения показали, что сочетание диссоциационного реагента В с реагентом А приводило к более тщательной диссоциации ткани сонной артерии по сравнению с использованием только диссоциационного реагента А. В общей сложности 176 000 одиночных клеток были собраны из девяти левых сонных артерий, при этом большинство сосудистых сосудов были успешно диссоциированы на одиночные клетки с высокой жизнеспособностью. После переваривания неконтролируемая кластеризация на основе SIRAH выявила четыре основных типа клеток в нормальных сонных артериях мышей.
