Для начала поддерживайте стерильность, очищая перчатки, картриджи и планшеты с 70% этанолом. Далее включаем компрессор для биопринтера и выбираем инициализированную кнопку для инициализации принтера. Протрите поверхности внутри принтера 70% этанолом.
С помощью кнопки «Прогон печати» загрузите файл печати и откройте файл Print Protocol PDF. Разморозьте биочернила, жидкости-активаторы и 50 миллилитров готового носителя при комнатной температуре. Подготовьте картридж в соответствии с инструкциями в протоколе печати PDF, обеспечив правильный объем реагентов в указанных отсеках.
Далее добавьте 1,2 миллилитра F3 к C1, 1,2 миллилитра F32 к C2 и 200 микролитров F261 к C4. Извлеките из инкубатора пластину, покрытую полиэтиленовым и ламининовым покрытием. Установите отсек держателя пластины на низкопрофильную пластину. Вставьте пластину в правый отсек для держателя пластины принтера.
Снимите крышку с тарелки и поместите ее в держатель крышки. Поместите картридж в биопринтер и нажмите кнопку «Печать инертного основания», чтобы начать печать. После размораживания центрифугируйте глутаматергические нейроны и астроциты, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте оба типа клеток отдельно в одном миллилитре полной среды.
Смешайте 20 микролитров клеточной суспензии с таким же объемом трипанового синего и подсчитайте клетки, чтобы определить жизнеспособную концентрацию клеток для каждого типа клеток. Затем объедините 3 миллиона глутаматергических нейронов с 1 миллионом астроцитов в 15-миллилитровой пробирке и добавьте полную среду, чтобы получить окончательный объем в восемь миллилитров. Центрифугируйте клеточную суспензию и аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулу.
Суспендировать гранулу в 200 микролитрах жидкости-активатора F299 путем пипетирования вверх и вниз. Поместите крышки на картридж и планшет для культивирования и извлеките их из биопринтера. В шкаф биобезопасности добавьте 200 микролитров клеточной суспензии в лунку С3 картриджа.
Снова вставьте картридж в биопринтер и снимите крышку, как показано ранее. Начните этап печати моделей в рамках тиража. Одновременно замените ламинированный носитель с 2D-контрольной пластины на готовый носитель.
Вставьте таргетную пластину биопечати в биопринтер и снимите крышку. Начните процесс таргетирования биоотпечатков. При появлении запроса снимите целевую пластину с биопринтера.
Используйте руководство, чтобы определить места, где на пластине можно наблюдать капли. Снова вставьте целевую пластину в биопринтер, чтобы повторить процесс печати и выбора капель. При появлении запроса замените таргетную пластину на тарелку для клеточной культуры.
После печати добавьте готовый носитель во все лунки для совместной 3D-культуры и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Наконец, утилизируйте картриджи и оставшиеся жидкости. в соответствии с протоколами лаборатории.
После семи дней печати почти не осталось ни одной клетки, а соединяющиеся пучки нейритов и астроцитарных проекций оказались укрепленными. Нарост нейритов линейно увеличивался между 12 и 156 часами. Во время разрастания нейритов кластеры клеточных тел также увеличивались в размерах.
Анализ жизнеспособности клеток показал, что примерно 72% от общего числа клеток были живыми на четвертый день, в то время как 29% были мертвы. Иммуноокрашивание подтвердило здоровую клеточную морфологию биопечатных нейронов и астроцитов, причем оба типа клеток демонстрируют рост клеточных выпячиваний. Глутаматергический фенотип нейронов был подтвержден путем иммуноокрашивания глутаматного рецептора 2.
