Диссоциация лептоменингов у мышей и ферментативное расщепление для эффективного культивирования лептоменингеальных клеток

Для начала осторожно надрежьте кожу жертвенной мыши, начиная с отверстия черепа и продолжая в сторону лобной области. С помощью ножниц деликатно приподнимайте и удаляйте череп, не повреждая лептоменинги, собирая весь мозг. Погрузите весь мозг в промывочный буфер и аккуратно промойте его, чтобы удалить поверхностную кровь.

Переложите мозг в стерильную чашку Петри, не измельчая. Затем под микроскопом с помощью тонкого пинцета извлеките лептоменинги с поверхности мозга. С помощью стерильных микроножниц разрежьте ткань лептоменинга на фрагменты.

Восстановите пищеварительную ферментную смесь с помощью данных компонентов. Добавьте к фрагментам 10 миллилитров смеси и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Аккуратно взбалтывайте, чтобы отсоединить осколки от дна трубки.

Затем добавьте 10 миллилитров буфера для остановки. Центрифугируйте суспензию при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. И с помощью пипетки аккуратно удалить надосадочную жидкость.

Добавьте 10 миллилитров холодного PBS и отфильтруйте любые комочки через ситечко 70 микрон в стерильную пробирку объемом 50 миллилитров. Поместите пластины с 10 до пятой клетки на квадратный сантиметр в покрытую фибронектином колбу Т25 с пятью миллилитрами питательной среды и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов. После инкубации замените среду свежей средой для устранения не прикрепленных клеток.